文章標(biāo)題：Chromosome-scale genome, together with transcriptome and metabolome, provides insights into the evolution and anthocyanin biosynthesis of?Rubus rosaefolius Sm.?(Rosaceae)

期刊名稱：Horticulture Research

影響因子：7.6

合作單位：凱里學(xué)院和貴州植物園

研究對(duì)象：薔薇科空心藨

研究方法：基因組、轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組學(xué)等

百邁客生物為該研究提供了基因組、轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究背景

薔薇屬(薔薇科)有12個(gè)亞屬，700余種，除南極洲外分布在世界各地。薔薇屬植物的組織，尤其是成熟的漿果，通常含有多種促進(jìn)健康的化合物(如花青素、酚酸和類黃酮)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如纖維素、維生素E和天然色素)。自古以來(lái)，它們就被用作藥物和水果。

空心藨(Rubus rosifolius Sm.)是一種天然生長(zhǎng)在東亞、東南亞、南亞、大洋洲、非洲和馬達(dá)加斯加的紅色覆盆子?？招乃懙闹?、葉、根長(zhǎng)期以來(lái)被用于止咳、祛風(fēng)、止血、濕。成熟的薔薇果實(shí)含有豐富的花青素、酚類物質(zhì)、三萜、甾醇等生物活性成分。因此，它具有多種藥理作用，包括抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗菌、防腐、抗增殖、抗癌、利尿、降壓等。此外，成熟的薔薇果實(shí)具有獨(dú)特的酸甜味道，顏色鮮艷，很有吸引力。綜上所述，薔薇是一種吸引人的野果，具有很高的商業(yè)價(jià)值，因此具有很大的馴化和栽培潛力。

實(shí)驗(yàn)材料

該研究以貴州植物園覆盆子種質(zhì)苗圃種植的一株薔薇為研究對(duì)象，進(jìn)行了基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組實(shí)驗(yàn)。對(duì)幼葉進(jìn)行基因組DNA提取分析。幼葉、幼莖、幼根、花萼、花瓣、雄蕊和3個(gè)幼果，發(fā)育天數(shù)分別為5、8和11天，三種著色漿果，分別發(fā)育14、17和19天，對(duì)發(fā)育21、23和25天的3個(gè)成熟果實(shí)進(jìn)行RNA提取，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。同樣的漿果也被用來(lái)進(jìn)行植物廣靶代謝組分析。

研究結(jié)果

1.基因組分析——基因組草圖組裝與注釋

該研究首先構(gòu)建并測(cè)序了空心藨的短讀文庫(kù)(350 bp)，獲得了59.76 Gb的數(shù)據(jù)和97.53%的合格reads (>Q20)。K-mer分析，估計(jì)空心藨基因組大小為220.50 Mb，重復(fù)率為33.31%，雜合度為1.64%。然后，構(gòu)建空心藨長(zhǎng)讀文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，組裝成241.76 Mb的基因組草圖，由141個(gè)連續(xù)序列(contigs)組成(N50 = 15.36 Mb)。最后，構(gòu)建并測(cè)序了空心藨的Hi-C文庫(kù)，獲得了> 1.65億個(gè)讀對(duì)。

利用這些有效的互作讀對(duì)對(duì)初步的基因組草圖進(jìn)行校正，得到了總共221.95 Mb的最終草圖，包含138個(gè)contigs (N50 = 16.13 Mb)。這些contigs進(jìn)一步聚集成131個(gè)支架(N50 = 30.0 Mb)。70個(gè)支架共219.02 Mb，占總組裝序列的98.68%，占估計(jì)基因組大小的99.33%，錨定在7條假染色體上。其中，20個(gè)支架(211.23 Mb)的位置和方向被確定，占錨定序列的96.44%。通過(guò)blast of essential genes (CEG)數(shù)據(jù)庫(kù)和BUSCO數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)估計(jì)該草圖基因組的組裝完整性，共鑒定出458個(gè)CEG的456個(gè)同源物(99.56%)和1614個(gè)BUSCO的1590個(gè)同源物(98.51%)。這些結(jié)果表明，組裝的空心藨基因組草圖具有較高的完整性。綜合各組組或支架的組裝完整性、無(wú)間隙度、N50等指標(biāo)，該研究組裝的草圖基因組超過(guò)了其他覆盆子物種。

從空心藨基因組組裝草圖中，通過(guò)從頭算預(yù)測(cè)、同源性預(yù)測(cè)和RNA-seq預(yù)測(cè)相結(jié)合，共鑒定出28067個(gè)蛋白編碼基因，在這些預(yù)測(cè)的基因中，1584個(gè)(98.14%)與BUSCOs(1614)同源，26173個(gè)(93.25%)可以被注釋為具有生物學(xué)或分子功能，這些帶注釋的轉(zhuǎn)座元件和蛋白質(zhì)編碼基因不均勻地分布在紅花的染色體上(圖1)。從紅花草圖基因組中鑒定了1500多個(gè)RNA基因，主要是rRNA和tRNA基因，以及一些假基因。

圖1-基因組分析

2.基因組分析——薔薇與其他9種植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及基因家族分析

為了研究空心藨的進(jìn)化關(guān)系，該研究分析比較了玫瑰、黃連、鵝掌楸、水稻、擬南芥、月季、花薔薇、桃李、中國(guó)栗、西方栗的基因集數(shù)據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，薔薇科出現(xiàn)在白堊紀(jì)，覆盆子出現(xiàn)在古近紀(jì)，空心藨和另一種紅覆盆子R. chingii在1728-3644萬(wàn)年前(mya)從最近的共同祖先分化而來(lái)，隨后空心藨的211個(gè)基因家族和36個(gè)基因家族分別擴(kuò)張和收縮(圖2)，這些擴(kuò)展家族中的基因主要富集于代謝途徑，如“DNA聚合酶”、“光合作用”、“晝夜節(jié)律”和“半乳糖代謝”。

圖2-基因組進(jìn)化樹分析

3.基因組分析——基因組共線性分析和重復(fù)事件分析

所有的植物都有一個(gè)或遠(yuǎn)或近的共同祖先。通過(guò)共線性分析發(fā)現(xiàn)：在1號(hào)染色體的一端和其他6條染色體上，發(fā)現(xiàn)了完整且平行的同源物，但在1號(hào)染色體的另一端缺失了大同源塊(圖3a)。這些結(jié)果表明，空心藨和紅覆盆子之間沒有發(fā)生大的染色體變異，但在空心藨和紅覆盆子基因組草圖的組裝或注釋中隱藏了錯(cuò)誤。該研究發(fā)現(xiàn)，空心藨和紅覆盆子之間所有染色體的共線性幾乎是完整的(圖3b)，這表明上述1號(hào)染色體的組裝或注釋錯(cuò)誤可能在空心藨中沒有發(fā)生。當(dāng)忽略單倍型中支架組裝方向的干擾時(shí)，1、2、3、5、7號(hào)染色體幾乎完全平行共線性，4號(hào)染色體可能發(fā)生較大反轉(zhuǎn)，6號(hào)染色體可能發(fā)生3次或更少的反轉(zhuǎn)(圖3b)。這些發(fā)現(xiàn)表明，隨著親緣關(guān)系距離的增加，復(fù)雜染色體變異的數(shù)量增加。

全基因組復(fù)制(WGD)分析發(fā)現(xiàn)。薔薇科其他成員與西方薔薇科同屬的共同祖先曾發(fā)生過(guò)WGD事件。

圖3-共線性分析?

圖4-重復(fù)事件分析

4.代謝組分析——漿果中花青素及其積累動(dòng)態(tài)

已有研究表明，空心藨漿果中含有豐富的花青素，特別是矢車菊素和天竺葵素。該研究利用植物廣靶代謝組技術(shù)鑒定到1330種代謝物，包括121種氨基酸和衍生物、248種酚酸、241種黃酮類、78種生物堿和151種萜類和有機(jī)酸。在黃酮類化合物中，有17種花青素在9種不同時(shí)期的漿果中檢測(cè)到，幼齡期(N1)、著色期(N2)和成熟期(N3)分別有3個(gè)、3個(gè)和3個(gè)。在N1向N2(發(fā)育期)過(guò)渡期間，總花青素和大多數(shù)種類花青素的濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，只有天竺葵素-3- O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-木糖苷和天竺葵素-3-O -(6’’- O -丙二酰基)葡萄糖苷繼續(xù)增加(圖5)，N2 ~ N3(發(fā)育階段)5種花青素(天竺葵素-3-O- (6 ’’-O-乙酰基)糖苷和芍藥色素-3-O-糖苷)濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，2種花青素(天竺葵素-3-O-蘆丁苷和飛燕草素- 3-O-(6’’-O-咖啡酰)糖苷)濃度略有下降，此外，總花青素和其他10種花青素均呈上升趨勢(shì)。8種(如天竺葵素-3- O -半乳糖苷和天竺葵素-3- O (6’’-O -乙酰基)葡萄糖苷)略有增加，2種(天竺葵素-3- O -(6’’-O-丙二酰基)葡萄糖苷)急劇增加(圖5)，這些結(jié)果表明，空心藨花青素的產(chǎn)生主要發(fā)生在成熟階段，其主要貢獻(xiàn)物質(zhì)是紅色色素天竺葵素3-O -葡萄糖苷和天竺葵素3- O -(6’’ -O-丙二酰基)?葡萄糖苷。

圖5-不同時(shí)期漿果花青素含量差異顯著

5.轉(zhuǎn)錄組分析——花青素生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因

轉(zhuǎn)錄組共鑒定出23997個(gè)基因在空心藨果實(shí)中不同水平表達(dá)。根據(jù)KEGG注釋，共鑒定出11個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其中花青素3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(RrBZ1)基因6個(gè)，分屬于5個(gè)家族，2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷2’’-O-木糖基轉(zhuǎn)移酶(RrUGT79B1)基因?qū)儆谝粋€(gè)家族，1個(gè)花青素3- O-葡萄糖苷5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(RrUGT75C1)基因和2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷6’-O-?；D(zhuǎn)移酶(Rr3AT)基因?qū)儆趦蓚€(gè)家族，參與了“花青素生物合成”途徑。此外，該研究還鑒定出22個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其中查爾酮異構(gòu)酶(RrCHI)基因10個(gè)，屬于6個(gè)家族，5個(gè)查爾酮合成酶(RrCHS)基因，屬于4個(gè)家族，4個(gè)雙功能flavanol 4-還原酶/flavanone 4-還原酶(RrDFR)基因，分屬于3個(gè)家族，一個(gè)類黃酮3’-單加氧酶(RrCYP75B1)基因，一個(gè)柚皮素3-雙加氧酶(RrF3H)基因，和一個(gè)花青素合成酶(RrANS)基因，參與“類黃酮生物合成”，在花青素生物合成中起著至關(guān)重要的上游作用。在這33個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、Rro04G036130.1 (RrBZ1)、Rro01G021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)、Rro04G035990.1 (RrCHS)、Rro04G036130.1 (RrCHS)、Rro07G006550.1 (RrCHI)和Rro05G014010.1 (RrANS)在漿果組織中表達(dá)量相對(duì)較高(圖6)。該研究推測(cè)這8個(gè)基因是參與空心藨花青素生物合成的主要基因。共有33個(gè)結(jié)構(gòu)基因在空心藨的花、葉和根組織中表達(dá)，但沒有一個(gè)在漿果中表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)表明，花青素代謝存在于空心藨的各個(gè)組織中，并不是單獨(dú)存在于果實(shí)中。

圖6-花青素生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)與調(diào)控

6.聯(lián)合分析——花青素生物合成的基因調(diào)控

為了探索空心藨紅漿果中花青素生物合成調(diào)控的分子機(jī)制，該研究對(duì)空心藨紅漿果幼齡期和成熟期的轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行了相關(guān)性分析。在成熟漿果中發(fā)現(xiàn)的主要花青素——芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷被鑒定為顯著差異積累代謝產(chǎn)物(DAMs)，其中11個(gè)結(jié)構(gòu)基因被發(fā)現(xiàn)為差異表達(dá)基因(DEGs)。其中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、rro07g035990.1和rro07g036130.1 (RrCHS)、rro07g06550.1 (RrCHI)、rro07g021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)和Rro05G014010.1 (RrANS)與芍藥苷-3-O-葡萄糖苷積累呈正相關(guān)，而Rro07g033620.1、Rro07g024760.1 (RrBZ1)、Rro07G009270.1 (RrUGT75C1)、Rro04G021540.1 (RrUGT79B1)與這兩種物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)(圖6b)。編碼屬于MYB、bHLH、AP2、bZIP、NAC和TCP家族轉(zhuǎn)錄因子的幾個(gè)DEGs的表達(dá)與上述一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因和兩個(gè)DEGs呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)(圖6b)。這些發(fā)現(xiàn)表明轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了空心藨花青素生物合成的調(diào)控。通過(guò)蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，該研究發(fā)現(xiàn)Rro4G033620蛋白(RrBZ1)與三甲基鳥苷合成酶1 (RrTGS1)直接相互作用，Rro5G003920蛋白(RrBZ1)直接與鐵氧還蛋白C1 (RrFDX1)、CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(RrNFYA)、谷氨酸合成酶1 (RrGLU1)和組蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子(RrCBF/NF-Y)相互作用，Rro1G021400蛋白(RrF3H)直接與RrFDR和RrANR相互作用(圖6c)。上述結(jié)果表明，空心藨花青素的合成受RNA甲基化、結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)控。

研究總結(jié)

該研究獲得了一個(gè)高質(zhì)量的染色體水平基因組草圖，包含35.7%的重復(fù)序列和28067個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。追蹤了薔薇科譜系特異性WGD事件，產(chǎn)生5090個(gè)目前可檢測(cè)的dgps，其中大多數(shù)進(jìn)行了純化選擇?？招乃懗墒旃麑?shí)花青素的積累主要是由芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二酰基)葡萄糖苷引起的。該研究發(fā)現(xiàn)了許多與花青素生物合成有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，它們的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因編碼的RNA甲基化和蛋白質(zhì)相互作用等遺傳機(jī)制的調(diào)控。研究結(jié)果可為空心藨及其他薔薇屬植物的定向馴化和育種提供參考。

文章標(biāo)題：Postharvest quality and metabolism changes of daylily flower buds treated with hydrogen sulfide during storage

期刊名稱：Postharvest Biology and Technology

影響因子：7.0

發(fā)表單位：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)和湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

研究對(duì)象：黃花菜

研究方法：生理指標(biāo)、植物廣靶代謝組學(xué)等

百邁客生物為本研究提供了植物廣靶代謝組檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究背景

在黃花菜中，花蕾是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好來(lái)源，含有大量的生物活性化合物，但在收獲后會(huì)變質(zhì)，這限制了黃花菜的口感和消費(fèi)者的滿意度。硫化氫(H2S)被認(rèn)為是一種重要的氣體信號(hào)分子，可以延長(zhǎng)水果和蔬菜的采后新鮮度。先前有研究表明，H2S通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化和增加抗氧化酶活性來(lái)延長(zhǎng)黃花菜采后壽命。然而，目前對(duì)H2S延緩黃花菜衰老的研究還停留在生理層面。H2S在黃花菜花蕾采后貯藏中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究旨在研究H2S對(duì)黃花菜采后品質(zhì)及貯藏過(guò)程中花蕾代謝變化的影響。

實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用黃花菜(萱草)“大同黃花”，產(chǎn)于中國(guó)山西省大同市云州區(qū)。花蕾是在商業(yè)成熟前采摘的。將剛采收的黃花菜花蕾在4℃預(yù)冷后，在4 h內(nèi)立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室?；ɡ兕伾?、形狀、大小均勻，無(wú)物理?yè)p傷，分為7組。將每組黃花菜芽(200 g)分別置于含有200 mL蒸餾水、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mM NaHS溶液(H2S供體)的干燥器中。干燥劑保存于4℃，相對(duì)濕度85% ~ 95%。測(cè)定了黃花菜的失重率、開花率、腐爛率和良花率，初步評(píng)價(jià)了黃花菜的品質(zhì)。

采后黃花菜T組選擇最佳H2S處理濃度，對(duì)照(CK組)以蒸餾水處理。連續(xù)處理6 d，每24 h更換一次處理液。從第0 d開始收集樣品進(jìn)行比較。蒸餾水處理的樣品記錄為CK0-6，H2S處理的樣品記錄為T1-6，每24 h一次。每次處理三次。CK0、CK6、T6進(jìn)行代謝組檢測(cè)。

研究結(jié)果

?1.生理分析——H2S抑制黃花菜貯藏過(guò)程中的失重、開花和腐爛

黃花菜在貯藏過(guò)程中，由于呼吸和蒸騰作用，水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗。結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組表現(xiàn)為嚴(yán)重失重，H2S處理緩解了黃花菜的失重，尤其是3.2 mM NaHS緩解效果最大。H2S處理能不同程度地延遲了黃花菜的開花，并能能較好地維持黃花菜的品質(zhì)。

圖1-H2S處理呈劑量依賴性地延緩了黃花菜花蕾品質(zhì)退化

2.生理分析——H2S對(duì)黃花菜MDA和H2O2含量有抑制作用

對(duì)比3.2 mM NaHS處理和未處理的黃花菜MDA含量，結(jié)果顯示，貯藏6 d內(nèi)，CK和H2S處理組MDA含量均持續(xù)升高。貯藏4 d后，H2S處理顯著抑制了MDA含量的增加。H2S處理的黃花菜在貯藏過(guò)程中H2O2的產(chǎn)生被阻斷。

圖2- H2S對(duì)黃花菜貯藏期間氧化應(yīng)激的影響

3.生理分析——H2S緩解了TP含量的下降，維持了黃花菜的抗氧化能力

在CK和H2S處理組中，TP含量均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。H2S處理減緩了TP含量的下降，且從第3 d開始出現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明H2S起到了阻斷蛋白的作用。H2S還改變了黃花菜的抗氧化系統(tǒng)。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，H2S處理組采后黃花菜GSH含量顯著高于CK組。黃花菜SOD活性呈下降趨勢(shì)，而H2S在第2 d開始顯著緩解了這種下降趨勢(shì)，維持在高于CK組的水平。CAT活動(dòng)結(jié)果表明，H2S處理組CAT活性活性顯著高于對(duì)照。

圖3-H2S對(duì)0 ~ 6 d黃花菜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及抗氧化系統(tǒng)的影響

4.代謝組分析——黃花菜貯藏過(guò)程中代謝物分析

為了進(jìn)一步研究H2S對(duì)黃花菜貯藏過(guò)程中品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制，利用植物廣靶代謝組學(xué)方法分析了NaHS處理后黃花菜代謝產(chǎn)物的變化。共鑒定了910種代謝物，包括429種初級(jí)代謝物和481種次生代謝物，分別為氨基酸、糖和醇、有機(jī)酸、脂質(zhì)、核苷酸、維生素、萜類、黃酮類、生物堿、多酚、“酮類、醛類、酸類”、苯丙素、類固醇、醌類、香豆素、木脂素和山酮。PCA分析顯示，CK0, CK6和T6三組在代謝水平上存在差異。

根據(jù)FC > 1、P < 0.05和VIP > 1的篩選標(biāo)準(zhǔn)，在CK0和CK6之間共鑒定出443個(gè)DAMs。其中，254種代謝物在CK0中上調(diào)，189種代謝物下調(diào)。這些DAMs代表了衰老黃花菜的主要成分變化，可分為17類，包括230種初級(jí)代謝物和213種次級(jí)代謝物。包括56種氨基酸、10種脂類、11種核苷酸、27種有機(jī)酸、28種糖和醇類、5種維生素、23種生物堿、3種香豆素、16種黃酮類、6種酮類、醛類、酸類、4種苯丙素、5種多酚類、2種醌類、8種類固醇、32種萜類和18個(gè)其他類。對(duì)于下調(diào)代謝物，鑒定了93種氨基酸(21種)、脂質(zhì)(22種)、核苷酸(7種)、有機(jī)酸(26種)、糖和醇(15種)、維生素(2種)的初級(jí)代謝物，以及96種生物堿(12種)、類黃酮(16種)、酮類、醛類、酸類(8種)、木脂素(1種)、苯丙素(7種)、多酚類(8種)、醌類(2種)、類固醇(3種)、萜類(23種)和其他(16種)的次級(jí)代謝物。KEGG富集分析表明，DAMs與氨基?；? tRNA生物合成、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、精氨酸生物合成、D -氨基酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝密切相關(guān)。

CK6和T6積累的差異代謝物表明H2S處理具有顯著影響。在396個(gè)顯著改變的DAMs中，152個(gè)上調(diào)，244個(gè)下調(diào)。氨基酸(66)，有機(jī)酸(47)，糖和醇(40)，脂質(zhì)(25)，核苷酸(21)和維生素(4)，萜類(51)，生物堿(32)，類黃酮(25)，酮類，醛類，酸類(14)，苯丙素(12)，多酚(10)，類固醇(9)，香豆素(5)，醌類(4)，其他類(31)。這些DAMs主要與甘油磷脂代謝、嘧啶代謝、戊糖、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝有關(guān)。

在之前的研究中，通過(guò)比較M6 (6 d采果)與M0 (0 d采果)和1-MCP(1-甲基環(huán)丙烯處理6 d采果)與M6積累的代謝物差異，發(fā)現(xiàn)了54種與李子果實(shí)成熟相關(guān)的常見代謝物。同樣，通過(guò)比較CK0與CK6、CK6與T6中的DAMs，共鑒定出303種重疊代謝物與黃花菜在儲(chǔ)存期間的成熟密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究H2S處理下黃花菜衰老的化學(xué)基礎(chǔ)和潛在機(jī)制，作者分析了CK0與CK6、CK6與T6對(duì)照組中這些常見DAMs的聚類熱圖。這些DAMs顯著富集在嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)化。在儲(chǔ)存第6 d時(shí)，胞苷5′-單磷酸、富馬酸、羥基乙酸、2′-脫氧胞苷-5′-單磷酸含量顯著下調(diào)，而H2S處理后其含量則上調(diào)，除胸苷和肌氨酸外，其余大部分DAMs經(jīng)H2S處理后均恢復(fù)正常。硫酸鹽、5′-單磷酸尿苷、l -精氨酸、l -瓜氨酸、n -乙酰鳥氨酸在CK0組和CK6組中下調(diào)，而在CK6組和T6組中則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。酮戊二酸、d -阿拉伯糖、d -阿拉伯糖醇、d -葡萄糖醛酸、l -異蘇氨酸、l -阿拉伯糖醇、l -天冬氨酸、l -絲氨酸、l -蘇氨酸、l -酪氨酸、丙二酸、甲基丙二酸、口角酸、利比醇、d -絲氨酸、l -同型絲氨酸-1、l -色氨酸在CK0和CK6處理中呈上調(diào)趨勢(shì)，但在H2S處理下呈抑制趨勢(shì)。結(jié)果表明，H2S可通過(guò)調(diào)節(jié)代謝水平延緩黃花菜衰老。

圖4- H2S處理下黃花菜廣靶代謝組學(xué)分析

圖5- H2S處理下黃花菜代謝物的差異積累

圖6-影響黃花菜貯藏期品質(zhì)變化的主要因素的鑒定

研究總結(jié)

在本研究中，評(píng)價(jià)了H2S對(duì)維持采后黃花菜品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，H2S作為一種抗氧化信號(hào)分子，抑制MDA和H2O2的積累，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和抗氧化GSH的積累以及抗氧化酶的活性，從而維持了黃花菜貯藏過(guò)程中的氧化還原平衡。利用廣靶代謝組學(xué)方法鑒定了采后黃花菜中代謝物，并分析了它們?cè)贖2S處理下的變化。共鑒定和量化了910種代謝物，包括不同的化合物類別，包括429種初級(jí)代謝物和481種次級(jí)代謝物。差異積累的代謝物主要分布在氨基酸、有機(jī)酸、糖和醇類、萜類中。在貯藏6 d內(nèi)，各種壩的相對(duì)含量發(fā)生變化，但經(jīng)H2S處理后則發(fā)生逆轉(zhuǎn)。在CK0與CK6、CK6與T6兩組間共發(fā)現(xiàn)303個(gè)共同DAMs。這些代謝物主要富集在嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)化的KEGG途徑中。代謝組學(xué)分析顯示，黃花菜在儲(chǔ)存和H2S處理期間存在廣泛的代謝重編程。H2S處理是維持黃花菜貯藏品質(zhì)的一種很有前途的方法。該研究為進(jìn)一步探索H2S處理下黃花菜代謝產(chǎn)物與采后品質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用提供了參考價(jià)值。

文章標(biāo)題：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning

期刊名稱：Postharvest Biology and Technology

影響因子：7.0

合作單位：韶關(guān)學(xué)院和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

研究對(duì)象：芋頭

研究方法：生理、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等

百邁客生物為該研究提供了植物廣靶、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析服務(wù)。

研究背景

在飲食中加入更多的新鮮蔬菜可以帶來(lái)許多健康益處，包括降低對(duì)慢性疾病的易感性和減緩衰老過(guò)程。市場(chǎng)上根莖類蔬菜切根產(chǎn)品的保質(zhì)期短，破壞了這些優(yōu)勢(shì)。切面褐變是限制切片蔬菜產(chǎn)品壽命的主要因素之一。因此，了解切片產(chǎn)品褐變背后的機(jī)制對(duì)于開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)至關(guān)重要，這些技術(shù)可以在儲(chǔ)存和消費(fèi)過(guò)程中有效地保持這些產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和整體質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用購(gòu)自中國(guó)韶關(guān)的“冰瑯玉”品種(Colocasia esculenta)。用于調(diào)查的芋頭大小相似，從大約800克到1000克不等，沒有任何明顯的缺陷或機(jī)械損傷。這些選定的芋頭被迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，為了確保清潔，在削皮和切割之前，要用自來(lái)水沖洗掉芋頭球莖表面殘留的淤泥。然后，將芋頭削皮，切成約1厘米厚的薄片作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。首先用次氯酸鈉溶液(0.1 g/L)對(duì)芋頭切片進(jìn)行滅菌。隨后，將無(wú)菌芋頭片密封在聚乙烯袋中(0.02 mm厚，尺寸為20 × 30 cm) (Xiao et al, 2020)。最后，芋頭切片冷藏(4℃)， RH為90-95%，持續(xù)12天。樣品每隔2天采集一次，用于后續(xù)分析。在第0天(C0)、第6天(C6)和第12天(C12)獲得的樣本用于植物廣靶代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

研究結(jié)果

1.生理分析——冷庫(kù)條件下芋頭片褐變?cè)u(píng)價(jià)

芋片切面顏色隨貯藏時(shí)間的變化如圖1A所示。切面L*值從0 d時(shí)的88.72下降到12 d時(shí)的80.36，冷藏12 d后L*值下降了9%(圖1A)。芋頭切片表面的a*、b*、△E和BI值在冷藏過(guò)程中也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)(圖1B-E)。這些褐變指標(biāo)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。冷藏12 d后，a*、b*、△E和BI值分別比0 d增加了582%、58%、725%和19%(圖1B-E)。宏觀褐變癥狀在第6天首次出現(xiàn)，并在隨后的儲(chǔ)存過(guò)程中逐漸加劇(圖1F)。綜上所述，這些結(jié)果表明，即使在低溫(4℃)條件下，切片芋頭在儲(chǔ)存過(guò)程中也會(huì)發(fā)生褐變。

為了闡明切片芋頭褐變的機(jī)制，研究人員分別在第0天、第6天和第12天對(duì)芋頭樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。

圖1-4℃貯藏期間切片芋頭的褐變發(fā)展

2.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程代謝組學(xué)分析

為了比較芋頭切片褐變過(guò)程中三個(gè)階段代謝物組成的差異，研究通過(guò)植物廣靶代謝組學(xué)分析，總共成功鑒定了芋頭切片中的638種代謝物。PCA分析顯示，三個(gè)儲(chǔ)存點(diǎn)采集的芋頭樣品具有明顯的分離性(圖2A)。在C0 vs C6中，共鑒定出206個(gè)DAMs，其中99個(gè)DAMs的豐度增加，107個(gè)DAMs的豐度減少。C6 vs C12共197個(gè)DAMs，分別有84個(gè)DAMs豐度增加，113個(gè)DAMs豐度減少。C0 vs C12包括119個(gè)DAMs，分別有51個(gè)DAMs和68個(gè)DAMs顯示豐度增加和減少(圖2B)。這些結(jié)果表明，在褐變過(guò)程中，代謝物豐度的減少幅度更大。

韋恩圖分析評(píng)估每個(gè)差異分組特有和共有的DAMs (圖2C)。圖2D-F展示了每個(gè)比較組中豐度增加和減少的top20的DAMs。C6組中10個(gè)代謝物豐度升高，如2′-脫氧腺苷、3-O-對(duì)香豆?？鼘幩帷 -乙酰- l -蘇氨酸、松柏醛、9(10)-EpOME、6-O-咖啡酰丁醇、表肌醇、l -同型半胱氨酸、5-O-對(duì)香豆?？鼘幩帷愂罄钏?。相反，琥珀酸酐、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、氨基丙酸、N6-(2-羥乙基)腺苷、2-(二甲氨基)鳥苷、芐基-(2 ‘-O-木糖基)葡萄糖苷、鳥苷、肌苷、D-甘露糖和肌苷5 ‘ -單磷酸在C6組中的豐度較低(圖2D)。

在C6和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- l-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、松木醛、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O-葡萄糖苷、6- O -對(duì)咖啡?；芄?、5-O-對(duì)香豆酰基奎寧酸、異鼠李素、反式- 4-羥基肉桂酸甲酯和3- O -對(duì)香豆?；鼘幩嵩贑12組中表現(xiàn)出更高的富集度。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、酪氨酸、S-Aiiyl-L-半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C6組中具有更高的豐度(圖2E)。

在C0和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- L-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、5- O -對(duì)香豆?；鼘幩?、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O -糖苷、松木醛、6- O -對(duì)咖啡酰基熊果甙、異鼠李素、3-O-對(duì)香豆酰基奎寧酸和反式-4-羥基肉桂酸甲酯在C12組中含量較高。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、肌苷、S – aiiyl -L -半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C0組中表現(xiàn)出更高的豐度(圖2F)。

圖2-切片芋頭植物廣靶代謝組分析

3.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程中DAMs的積累模式

為進(jìn)一步分析代謝物在9個(gè)樣本的積累模式，該研究進(jìn)行了聚類熱圖分析。結(jié)果顯示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變程度逐漸增加，推測(cè)持續(xù)增加的DAMs可能有助于切片芋頭的褐變或促進(jìn)其褐變過(guò)程。因此，該研究關(guān)注分析在褐變過(guò)程中豐度持續(xù)上升的DAMs (圖3B-L)。確定了11個(gè)DAMs在褐變過(guò)程中豐度持續(xù)增加，如2-α-亞麻烯酰甘油、甘油亞油酸、(9Z,11E)-十八烯二烯酸、N-油基乙醇胺、γ-亞麻酸、1-亞麻油基甘油、2-亞麻油基甘油、N-α-乙?；? L-鳥氨酸、α-亞麻酸、9-羥基-10、12-十八烯二烯酸和1-α-亞麻烯酰甘油。值得注意的是，在這11個(gè)DAMs中，有10個(gè)是脂肪酸或脂質(zhì)衍生物。幾種褐變指標(biāo)與這些水DAMs之間的相關(guān)系數(shù)非常高。這些結(jié)果表明，在切片芋頭中脂質(zhì)代謝與褐變發(fā)展之間存在潛在的聯(lián)系。

圖3-切片芋頭中差異代謝物(DAMs)的積累模式

4.轉(zhuǎn)錄組分析——冷藏芋頭切片褐變過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

為了更好地了解基因表達(dá)的變化，該研究進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示許多基因在芋褐變過(guò)程中表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜。具體來(lái)說(shuō)，在C0和C6的比較中，鑒定出3103個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和1685個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。同樣，在C6和C12組的比較中，發(fā)現(xiàn)3021個(gè)DEGs上調(diào)，2350個(gè)DEGs下調(diào)。此外，與C0組相比，C12組有5108個(gè)基因的表達(dá)量更高(圖4A)。在褐變過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了更多的上調(diào)基因，表明芋頭的基因表達(dá)發(fā)生顯著的變化。有趣的是，當(dāng)比較C0與C6、C6與C12、C0與C12之間的DEGs時(shí)，發(fā)現(xiàn)1396個(gè)DEGs重疊(圖4B)。

根據(jù)褐變過(guò)程中的表達(dá)模式，將DEGs分為6個(gè)簇。每個(gè)聚類(從1到6)分別由1607、1293、533、1741、634和2470個(gè)度組成(圖4C)。KEGG富集分析顯示，簇1中有四個(gè)途徑的DEGs顯著富集:α-亞麻酸代謝、生物素代謝、植物-病原體相互作用以及淀粉和蔗糖代謝(圖4D)。此外，集群2中的DEGs在α-亞麻酸代謝、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成途徑中富集(圖4E)。

圖4-切片芋頭褐變過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

5.聯(lián)合分析——基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝與冷藏芋頭切片褐變之間的關(guān)系，研究采用WGCNA分析進(jìn)行研究。如圖5A所示，鑒定出兩個(gè)與切片芋頭在冷藏期間褐變發(fā)育顯著相關(guān)的模塊。藍(lán)色模塊中基因與褐變BI、a*、b*、△E 4項(xiàng)指標(biāo)呈正相關(guān)，而綠松石模塊中基因與褐變指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)(圖5B)。此外，隨著褐變的發(fā)展，藍(lán)色模塊中基因的表達(dá)量逐漸增加，而綠松石模塊中基因的表達(dá)量逐漸減少(圖5C)。此外，藍(lán)色和綠松石模塊中每個(gè)基因與褐變的相關(guān)性都很高(圖5D)，說(shuō)明這兩個(gè)模塊的基因與冷藏芋頭片的褐變發(fā)育高度相關(guān)。

切片芋頭的褐變與藍(lán)色模塊中的基因正相關(guān)，對(duì)該模塊中的基因進(jìn)行了KEGG富集分析。在top20個(gè)富集的KEGG通路中，泛素介導(dǎo)的蛋白水解、α-亞麻酸代謝和谷胱甘肽代謝是富集最顯著的通路。尤其是α-亞麻酸代謝途徑和甘油脂代謝途徑中分別富集了14個(gè)和18個(gè)基因(圖5E)。這些結(jié)果為脂質(zhì)代謝參與切片芋頭褐變的事實(shí)提供了進(jìn)一步的線索。

圖5-WGCNA對(duì)模塊與性狀的相關(guān)性分析

6.基因驗(yàn)證——參與亞麻酸代謝的DEGs的表達(dá)模式

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量，研究檢測(cè)了亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達(dá)模式。在切片芋頭褐變過(guò)程中，該途徑中的DEGs差異表達(dá)(圖6A)。在這些基因中，4個(gè)基因(taro_028466、029177、001379和new gene_1582)的表達(dá)量在第6天較0天下降(圖6A)。10個(gè)基因(taro_026230、017933、007794、026197、032526、040173、011856、050352以及new gene_27424和3563)的表達(dá)量在第6天出現(xiàn)了增加，隨后又出現(xiàn)了下降。然而，這些基因在第12天的表達(dá)水平仍然高于第0天(圖6A)。其余15個(gè)基因在褐變過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)增加。這些結(jié)果再次證實(shí)了亞麻酸代謝參與了芋頭褐變過(guò)程。

作者選擇了5個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析(圖6B-F)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)或褐變程度的惡化，這5個(gè)基因的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)。此外，通過(guò)RNA-seq和qRT-PCR分析確定的這些基因的總體表達(dá)模式高度一致(圖6B-F)，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。

圖6-亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達(dá)模式

7.基因驗(yàn)證——在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化作用加劇

上述結(jié)果表明，膜脂代謝可能在芋頭褐變過(guò)程中起一定作用。為了進(jìn)一步研究，評(píng)估了參與膜脂過(guò)氧化的關(guān)鍵DEGs的表達(dá)譜，如脂肪酶(LIP)和脂氧合酶(LOX)。三個(gè)差異表達(dá)的LIP基因在褐變過(guò)程中表達(dá)持續(xù)增加。LOX基因，除了8個(gè)LOX基因在褐變過(guò)程中逐漸增加，其他基因在褐變過(guò)程中表達(dá)先增加后下降 (圖7a)。這些結(jié)果表明，新鮮切割操作(如剝皮和切割)激活了芋頭的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。

丙二醛通常被認(rèn)為是植物脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)志物。為了監(jiān)測(cè)切片芋頭褐變過(guò)程中膜脂過(guò)氧化情況，測(cè)定了LOX活性和MDA含量。隨著時(shí)間的推移，LOX活性和MDA含量隨著褐變繼續(xù)進(jìn)行逐漸升高 (圖7B, C)。這些結(jié)果表明，在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化加劇。此外，相關(guān)分析顯示，LOX活性、MDA含量和其他褐變指標(biāo)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性?(圖7D)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了膜脂過(guò)氧化和/或代謝參與芋頭褐變。

圖7-膜脂過(guò)氧化的評(píng)價(jià)

研究總結(jié)

切面褐變的發(fā)生是鮮切行業(yè)中切片芋頭生產(chǎn)和商業(yè)化的一個(gè)重要障礙。代謝組學(xué)分析顯示，在芋頭褐變過(guò)程中，亞麻酸及其衍生物以及氫過(guò)氧化物的含量增加，表明發(fā)生了膜脂降解。RNA-seq分析顯示，參與褐變過(guò)程的DEGs富集于α-亞麻酸代謝途徑。WGCNA分析得到了兩個(gè)與芋頭褐變密切相關(guān)的模塊，其中藍(lán)色模塊的基因與BI呈正相關(guān)，強(qiáng)化了膜脂代謝與芋頭褐變之間的聯(lián)系。隨著芋頭褐變的進(jìn)行，LOX基因的表達(dá)和蛋白活性以及MDA的水平增加，表明膜脂過(guò)氧化促進(jìn)了切片芋頭褐變。總之，該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了膜脂代謝在切片芋頭褐變中的重要性。這項(xiàng)研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組分析全面研究了芋頭褐變的機(jī)制。

合作單位：丹麥奧胡斯大學(xué)

文章標(biāo)題：Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition

期刊名稱：Circulation

影響因子：37.8

研究對(duì)象：小鼠、臨床隊(duì)列

測(cè)序技術(shù)：宏基因組測(cè)序、代謝組檢測(cè)。

百邁客生物為該研究提供了宏基因組測(cè)序服務(wù)。

研究背景

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）主要在腎臟近曲小管S1段表達(dá)，負(fù)責(zé)對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量重吸收。SGLT2 抑制劑（SGLT2i）是治療高血糖的有效療法，在2型糖尿病患者中，還可以保護(hù)心臟和腎臟免于衰竭。SGLT2i被認(rèn)為具有許多作用和多效機(jī)制，涵蓋增強(qiáng)生酮和類禁食代謝反應(yīng)、腎臟和全身血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。然而，目前還未有研究闡明SGLT2i保護(hù)心血管和腎臟的關(guān)鍵機(jī)制，該機(jī)制對(duì)于心血管和腎臟保護(hù)至關(guān)重要。

丹麥奧胡斯大學(xué)學(xué)者在Circulation雜志上發(fā)表題為“Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition“研究論文，研究團(tuán)隊(duì)使用Akita小鼠模型和臨床隊(duì)列樣品，通過(guò)整合宏基因組、代謝組、蛋白組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，確定了SGLT2i對(duì)腎臟、心臟、血管和其他器官的幾種SGLT2依賴性效應(yīng)和脫靶效應(yīng)，通過(guò)重構(gòu)腎臟代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)和全身代謝通訊，發(fā)揮心腎保護(hù)作用。提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和宏蛋白質(zhì)組的新見解，從而為SGLT2i新型和早期機(jī)制靶標(biāo)提供了潛在的路線，促進(jìn)代謝藥物的開發(fā)。

材料方法

小鼠SGLT2i處理

19 只 8 周齡 C57BL/6J 雄性小鼠和 16 只糖尿病 C56BL/6-Ins2Akita/J 雄性小鼠，然后給予WD4周，WD后1周添加達(dá)格列凈或驅(qū)避WD飲食（vehicle；WT，n=9；Akita，n=8）。

組學(xué)技術(shù)

盲腸糞便宏基因組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)

腎組織、尿液、血漿非靶向代謝組

腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織蛋白質(zhì)組

研究結(jié)果

1、綜合組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)和翻譯策略概述

該研究旨在闡明SGLT2i的生理機(jī)制。作者假設(shè)大量的代謝器官通訊是對(duì)SGLT2i的反應(yīng)而發(fā)生的，因此選擇了綜合組學(xué)方法。對(duì)非糖尿病小鼠的所有主要代謝器官、生物體液和腸道微生物群以及Akita小鼠單純性高血糖的早期階段進(jìn)行了綜合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Akita鼠是1型糖尿病的遺傳小鼠模型，長(zhǎng)期SGLT2i處理對(duì)其有改善作用（圖1A 和1B）。研究短期暴露于SGLT2i 1周，目的是確定主要代謝效應(yīng)和可能建立保護(hù)作用的代謝通訊，而不是研究長(zhǎng)期治療后器官功能改善的后果。選擇高脂肪西方飲食（WD）是為了模仿西方生活方式的代謝環(huán)境。選擇達(dá)格列凈是因?yàn)槠鋵?duì)患有和不患有糖尿病的患者具有心臟保護(hù)和腎臟保護(hù)特性。作者通過(guò)研究分析發(fā)現(xiàn)了一些意想不到的代謝信號(hào)（圖1C）。在后續(xù)研究中，將人腸道微生物培養(yǎng)物暴露于SGLT2i，使用SGLT2敲除 (KO) 小鼠來(lái)探測(cè)SGLT2i的脫靶效應(yīng)，并在人腎、患者血漿和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 中進(jìn)行翻譯驗(yàn)證。同時(shí)在人腎、患者血漿和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （hiPSC）中進(jìn)行驗(yàn)證（圖1D）。所得數(shù)據(jù)提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和元蛋白質(zhì)組的新見解，從而揭示了SGLT2i的下游通路，這也為代謝性疾病藥物的開發(fā)提供了新思路。

圖1-研究設(shè)計(jì)和表型概述

2、匹配綜合有機(jī)組學(xué)發(fā)現(xiàn)和翻譯策略概述

使用達(dá)格列凈或溶劑對(duì)照一周后，對(duì)同一動(dòng)物的主要代謝器官的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行了深度多組學(xué)分析（圖1A和1B）。結(jié)果表明，達(dá)格列凈可降低Akita小鼠的血漿葡萄糖水平，但不會(huì)降低非糖尿病WT小鼠的血漿葡萄糖水平。達(dá)格列凈在WT小鼠中誘導(dǎo)糖尿，但在Akita小鼠中沒有觀察到明顯的進(jìn)一步增加（圖S1A）。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，在腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織中總共鑒定到9501個(gè)蛋白質(zhì)（8421個(gè)基因）和10744個(gè)磷酸化位點(diǎn)。其中，大多數(shù)SGLT2i引起的顯著變化是在腎臟中觀察到的。

3、SGLT2抑制對(duì)腎臟蛋白質(zhì)組的重新配置

定量了腎皮質(zhì)中的6676種蛋白質(zhì)，其中在WT組鑒定到6107種蛋白質(zhì)，Akita小鼠鑒定到6207種蛋白質(zhì)。分析表明，SGLT2i對(duì)腎臟蛋白質(zhì)組的影響比糖尿病小鼠更強(qiáng)：在WT小鼠中，SGLT2i增加了455種蛋白質(zhì)，減少了485種蛋白質(zhì)(圖2A)。SGLT2i治療糖尿病小鼠的蛋白質(zhì)變化較少(29個(gè)增加，53個(gè)減少)。兩組小鼠腎臟線粒體蛋白豐度均有顯著變化，但只有WT組小鼠體內(nèi)線粒體膜蛋白顯著上調(diào)(圖S2A)。此外，只有WT小鼠對(duì)SGLT2i有反應(yīng)，腎臟頂端或基側(cè)膜上的蛋白質(zhì)(圖2B)或參與mRNA剪接的蛋白質(zhì)下調(diào)。在WT小鼠中觀察到的更強(qiáng)烈的變化之后，GO富集分析表明，跨各種功能相互連接的蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生了一致的變化，大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在WT小鼠中被SGLT2i下調(diào)。

圖2-綜合蛋白質(zhì)組/相互作用組分析表明SGLT2i對(duì)腎臟代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的廣泛重塑

4、SGLT2i降低血漿腸源性有機(jī)陰離子(尿毒癥毒素)水平，盡管腎臟分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)降低

為了確定除了葡萄糖之外的其他代謝信號(hào)通路是否影響了整體代謝譜，作者在選定的器官和生物體液中進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，總共有186種代謝物發(fā)生了顯著變化（所有器官總計(jì)322種）。作者發(fā)現(xiàn)SGLT2i主要影響尿液和血漿中代謝物的豐度，并且與糖尿病小鼠相比，非糖尿病小鼠受影響的分子多樣性更廣泛（圖3A）。

SGLT2抑制劑（SGLT2i）改變了腎蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組，同時(shí)調(diào)控其他代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其抑制作用引起了血漿和尿液代謝物的顯著變化。因此，研究者提出腎蛋白質(zhì)組的重編程可能部分解釋了觀察到的代謝物變化。文章中指出了可能影響體液循環(huán)代謝物組成的多個(gè)過(guò)程，包括尿液排泄的改變（圖3B）。在WT小鼠中，SGLT2i在腎臟中減少了27種SLC的表達(dá)。結(jié)合這些結(jié)果和尿液代謝譜，表明了SGLT2i可能通過(guò)影響其他器官的代謝物組成，從而導(dǎo)致尿液中代謝物的變化（圖3C）。

接下來(lái)，作者分析了血漿和尿液中代謝物的含量，這些代謝物可以反映對(duì)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)的主要影響。正如預(yù)期的那樣，葡萄糖和多種其他糖代謝物的血漿：尿液比率下降（圖3D），可能是因?yàn)槟I小管重吸收減少。血漿：尿液比率增加的代謝物是賴氨酸代謝物，包括二氨基庚二酸、三甲基賴氨酸、哌可酸和氨基己二酸，一種針對(duì)小鼠模型中肥胖和糖尿病的保護(hù)性代謝物。許多響應(yīng)SGLT2i而增加血漿：尿液比率的化合物是近端腎小管有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1的底物（圖3D）：其中包括乙酰半胱氨酸、瓜氨酸、葡萄糖酸鹽和蛋氨酸， 表明這些化合物的腎臟分泌可能會(huì)減少。蛋白質(zhì)組分析結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，即SGLT2i降低了WT中OAT1和OAT3的表達(dá)，腎膜組分的免疫印跡分析證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3E）。與此同時(shí)，觀察到SGLT2i降低了所謂的滯留毒素或尿毒癥毒素的血漿水平（圖3A）。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，對(duì)已知在腎臟疾病中保留且主要由腸道微生物組產(chǎn)生的血清代謝物進(jìn)行了針對(duì)性分析。SGLT2i減少了 WT 小鼠血漿中的許多尿毒癥毒素，包括PCL、ILA、鄰氨基苯甲酸、香草酸和3-吲哚基硫酸鹽（圖3F）。在獨(dú)立的非糖尿病動(dòng)物模型（高血壓Dahl SS大鼠）中，SGLT2i 同樣顯著降低了PCL硫酸鹽和ILA：尿液比率（圖S4E）。如前所述，這不能通過(guò)腎尿毒癥毒素 (OAT1/OAT3) 分泌能力的下調(diào)來(lái)解釋，并且表明SGLT2i改變了這些化合物的形成。

圖 3-非靶向代謝組分析揭示了SGLT2i誘導(dǎo)的氨基酸和有機(jī)陰離子代謝變化

5、SGLT2i重組尿毒癥毒素氨基酸腸道菌群發(fā)酵

許多尿毒癥毒素是由菌群產(chǎn)生的，SGLT2i改變尿毒癥毒素的代謝物，主要來(lái)自苯丙氨酸和色氨酸。因此，作者假設(shè)SGLT2i影響菌群，從而改變這些代謝物的產(chǎn)生。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，使用宏基因組輔助宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析了匹配的盲腸微生物組（圖 S6A）。通過(guò)宏基因組學(xué)總共發(fā)現(xiàn)了6899個(gè)物種。將其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)組，定量了這些物種的14621個(gè)蛋白質(zhì)（WT為8249個(gè)，Akita小鼠為10847個(gè)），與Akita小鼠相比，SGLT2i在WT中的作用更強(qiáng)。系統(tǒng)發(fā)育概述總結(jié)了SGLT2i在WT小鼠中從門到科水平對(duì)微生物群的重新配置（圖4A）。在屬水平上，SGLT2i促使Akkermansia 和Lachnoclostridium增加，Acetatifactor和Bilophila減少（圖S6B）。

宏蛋白質(zhì)組的多樣性分析顯示，治療后糖尿病小鼠的α多樣性較高，而WT和糖尿病小鼠的對(duì)照和治療動(dòng)物的β多樣性顯著不同。宏蛋白質(zhì)組分析還涵蓋了消化道的典型蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)蛋白質(zhì)被SGLT2i 下調(diào)，34個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)。與腎臟一樣，一些減少的蛋白質(zhì)參與營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，包括寡肽的Slc15a1、尿酸鹽/外源性分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Abcg2和脂肪酸輸入的Slc27a4。

由于WT小鼠中SGLT2i改變的許多血漿溶質(zhì)是芳香族氨基酸的代謝物，因此分析了可以在蛋白質(zhì)組水平上代謝這些氨基酸的細(xì)菌的豐度。對(duì)于產(chǎn)生吲哚的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)表達(dá)色氨酸酶以從色氨酸產(chǎn)生吲哚的物種減少（吲哚丙烯酸；圖4B）。

使用苯丙氨酸等芳香族氨基酸作為底物可以減少甲酚和苯酚的生成劑（圖4B）。糞便代謝組檢測(cè)表明顯示糞便中存在達(dá)格列凈（圖4C）。在達(dá)格列凈治療小鼠的這些糞便樣本中，色氨酸和苯丙氨酸發(fā)酵的代謝物有所減少（圖4C）。為了探究達(dá)格列凈在糞便中的直接作用，將SGLT2i添加到人糞便中。厭氧發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)吲哚乳酸、色氨酸代謝物和肉桂酰甘氨酸減少（圖4D）；也就是說(shuō)，與WT小鼠血漿中SGLT2i 減少的化合物相關(guān)的化合物（圖3F）。在人體糞便發(fā)酵中添加SGLT2i也逆轉(zhuǎn)了這些毒素母體分子的消失，特別是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸（圖4D）。

這表明SGLT2i對(duì)微生物群產(chǎn)生較少尿毒癥毒素的生理作用也可能涉及SGLT2i對(duì)微生物群的直接影響。

圖4-代謝蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，SGLT2i重塑和減弱了氨基酸微生物組發(fā)酵為尿毒癥毒素的能力

6、SGLT2I對(duì)尿毒癥毒素代謝產(chǎn)物的凈減少不依賴SGLT2

作者進(jìn)一步檢測(cè)了還原的代謝物是否獨(dú)立于SGLT2蛋白的存在，以及這些影響是否在更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)保持。使用了SGLT2 KO小鼠模型（SGLT2 KO）。用SGLT2I（達(dá)格列凈）對(duì)SGLT2 KO和WT小鼠進(jìn)行了16周的正常飲食治療，分析了血漿和尿液，并使用保留代謝物小組進(jìn)行了血漿靶向分析(圖5A)。SGLT2 KO小鼠的血糖較低，葡萄糖排泄量較高，食物攝入量較高(圖5B和圖S6E)。在KO小鼠中，SGLT2i不影響這些措施中的任何一項(xiàng)。

在SGLT2 KO和WT小鼠中，許多代謝物的比率發(fā)生了類似的變化，就像在WT小鼠中使用達(dá)格列凈和溶劑處理一樣(圖5C左圖)，這表明SGLT2抑制的后果。在其他方面，葡萄糖比率的下降，反映了尿糖排泄的增加。正如預(yù)期的那樣，SGLT2的缺失阻斷了達(dá)格列凈對(duì)葡萄糖排泄的影響(圖5C右圖)。另一方面，達(dá)格列凈顯著改變了SGLT2 KO小鼠體內(nèi)許多代謝物的比例，表明了一種偏離靶點(diǎn)的效應(yīng)(圖5D)。血漿：尿液比例的排名變化顯示，達(dá)格列凈降低了SGLT2 KO小鼠中多種芳香酸代謝物的比例，包括甲酚和馬尿酸鹽，其次是色氨酸代謝物。血漿水平分析確定了SGLT2i在SGLT2 KO環(huán)境中顯著改變的5種代謝物，包括PCL硫酸鹽和一種修飾的馬尿酸(圖5E和5F)。該實(shí)驗(yàn)表明SGLT2i治療具有非靶點(diǎn)效應(yīng)，包括對(duì)甲酚、馬尿酸鹽和色氨酸代謝物。

圖5-利用SGLT2 KO小鼠探索SGLT2i的代謝脫靶效應(yīng)

7、SGLT2i的代謝器官通訊效應(yīng)在人類中是相關(guān)的

鑒于腎臟SGLT2相互作用組以及微生物對(duì)SGLT2i的反應(yīng)在小鼠和人類中相似，我們想知道SGLT2i是否會(huì)影響循環(huán)中的溶質(zhì)，在縱向數(shù)據(jù)中與心血管相關(guān)。對(duì)來(lái)自2個(gè)獨(dú)立研究的患者的血漿樣本進(jìn)行了靶向代謝組分析，目標(biāo)是80個(gè)有機(jī)陰離子和尿毒癥毒素。在第一組>40名患者中，在失代償性心衰的真實(shí)環(huán)境中分析了這種影響(圖6A)。結(jié)果表明，SGLT2i顯著降低或鈍化了心力衰竭患者血漿中幾種有機(jī)陰離子的增加，但僅當(dāng)住院期間添加SGLT2i時(shí)(圖6B和6C)。包括幾種色氨酸代謝物，如ILA、犬尿酸和乙酰色氨酸，以及苯丙氨酸代謝物苯乙酰谷氨酰胺和PCL硫酸鹽。分析了在糖尿病患者中使用SGLT2I(依帕列凈)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的縱向數(shù)據(jù)(圖6D)。與基線和安慰劑相比，二甲基尿酸和三甲基尿酸的血漿濃度降低，PCL降低，吲哚代謝物增加緩慢(圖6E和6F)。在兩項(xiàng)臨床研究中，降低的溶質(zhì)大部分來(lái)自嘌呤代謝和腸道芳香氨基酸代謝，這與在小鼠身上觀察到的代謝器官一致。

圖6-SGLT2i 誘導(dǎo)的尿毒癥毒素減少也適用于人類

8、SGLT2i依賴代謝物對(duì)甲酚誘導(dǎo)人EHT應(yīng)激信號(hào)

在人類、小鼠（包括Sglt2 KO小鼠）和大鼠研究中的不同循環(huán)代謝物之間觀察到一致的總體趨勢(shì)（圖7A），在觀察到的所有系統(tǒng)中，SGLT2i均一致降低PCL硫酸鹽或 PCL。為了分析這種化合物對(duì)人體組織的影響，將hiPSC EHT暴露于PCL。PCL在先前報(bào)道的患者濃度（300 μM）68,69 下改變了心肌細(xì)胞的松弛時(shí)間（圖7B）。數(shù)小時(shí)內(nèi)濃度提高十倍（低mM 范圍）顯著降低了力和頻率（圖7C和圖S7A），當(dāng) EHT 受到頻率控制時(shí)也是如此（圖S7B）。PCL 對(duì) EHT 的影響是部分可逆的，可以通過(guò)洗掉化合物來(lái)恢復(fù)（圖7C ）。

為了進(jìn)一步闡明該機(jī)制，對(duì)用300μM PCL、吲哚乳酸和3種其他芳香族代謝物處理的 EHT 組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖7D）。觀察到最強(qiáng)烈的變化是 PCL 的反應(yīng)（圖7D）。多種蛋白質(zhì)的增加包括心臟病相關(guān)通道TRPM4、 FLNA和生長(zhǎng)因子CCN1；減少的蛋白質(zhì)包括 PPP1R1A，其下調(diào)已被報(bào)道為人類HF的標(biāo)志。PCL改變的蛋白質(zhì)組的一個(gè)獨(dú)特特征是心臟肌節(jié)相關(guān)蛋白的減少（圖S7D），以及應(yīng)激信號(hào) GDF15的強(qiáng)烈感應(yīng)（圖7E）?？紤]到HF患者中該通路的調(diào)節(jié)，檢測(cè)了GDF15 水平，發(fā)現(xiàn)接受SGLT2i治療心力衰竭的患者循環(huán) GDF15 減少（圖7F）。

圖7-SGLT2i調(diào)節(jié)的尿毒癥毒素對(duì)甲酚對(duì)人體工程心臟組織的影響

研究總結(jié)

該研究通過(guò)整合多個(gè)代謝器官和體液樣品，進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SGLT2i減少了尿毒癥毒素（如對(duì)甲酚硫酸鹽）的微生物群形成，從而減少了它們的體內(nèi)暴露和腎臟解毒的需要，結(jié)合SGLT2i對(duì)腎臟的直接影響，包括較少的近端小管葡萄糖毒性和對(duì)頂端轉(zhuǎn)運(yùn)體（包括鈉、氨基酸和尿酸鹽的攝?。┑膹V泛下調(diào)，為腎臟和心血管保護(hù)提供了代謝基礎(chǔ)。該研究提供的資源為更深入地了解SGLT2抑制劑對(duì)代謝、腎臟和心臟功能的影響，從而對(duì)維持心血管健康提供了新的見解。

期刊名稱：Molecular Plant

影響因子：21.949

發(fā)表單位：中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

研究部位：高等植物及綠色生物

研究方法：磷酸化蛋白質(zhì)組、PRM靶向蛋白組

研究背景

2023年11月27日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團(tuán)隊(duì)在Molecular Plant在線發(fā)表了題為GreenPhos, a universal method for in-depth measurement of plant phosphoproteomes with high quantitative reproducibility?的研究論文。論文中報(bào)道了一種具有突破性的植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)采用了簡(jiǎn)化、穩(wěn)健的工作流程，有效地克服了植物磷酸化蛋白質(zhì)組分析的主要技術(shù)難點(diǎn)，能高靈敏度、高特異性快速地富集植物磷酸肽。利用該技術(shù)可定量分析不同植物的磷酸蛋白質(zhì)組，其分析深度之深、定量重復(fù)性之高前所未有，有望成為植物磷酸蛋白組學(xué)的通用技術(shù)。由于該技術(shù)主要面向高等植物及其它綠色生物（如衣藻），且操作簡(jiǎn)便，極大地降低了實(shí)驗(yàn)所需的人力和試劑費(fèi)用，因此命名為GreenPhos (綠磷)。

蛋白質(zhì)磷酸化在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)以及作物的產(chǎn)量和品質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。深度解析磷酸化蛋白質(zhì)組是全面理解磷酸化如何行使功能的有效手段。然而，與動(dòng)物相比，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的深度解析在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性。因?yàn)橹参锛?xì)胞具有致密的細(xì)胞壁和大量的包括色素在內(nèi)的次生代謝物，前者極大地增加了蛋白質(zhì)提取的難度，而后者嚴(yán)重地干擾了磷酸肽富集的效率和特異性。

實(shí)驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Col-0)幼苗在10%漂白劑中表面消毒，在無(wú)菌去離子水中漂洗，然后播種在含有1%瓊脂，pH為5.8的半強(qiáng)度Murashige和Skoog (1/2 MS)培養(yǎng)基上。種子在4℃的黑暗條件下發(fā)芽2天。幼苗在1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天，然后轉(zhuǎn)移到1/2 MS液體培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)16小時(shí)。在鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中，將幼苗轉(zhuǎn)移到添加或不添加(對(duì)照) 100mM NaCl的新鮮培養(yǎng)基中，根據(jù)需要孵育30 min或120 min。

研究結(jié)果

1.GreenPhos的開發(fā)——一種穩(wěn)定高效的純化植物磷酸肽的方法

從植物組織中高效提取蛋白質(zhì)是深入分析植物蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的第一步和關(guān)鍵一步。為此，作者比較了SDS、GdnHCl和SDC等不同變性劑對(duì)擬南芥葉片中蛋白質(zhì)的提取性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDS-和SDC-提取的蛋白的性能相似，但優(yōu)于GdnHCl。植物樣品相較于動(dòng)物樣品含有較低濃度的蛋白質(zhì)，因此作者優(yōu)化了磷酸化蛋白質(zhì)組的提取和富集的方法，即用SDS或GdnHCl緩沖液提取的蛋白質(zhì)樣品，在蛋白質(zhì)消化和隨后的磷酸肽富集之前，必須去除變性劑(圖1A)。接著用氯仿-甲醇沉淀提取的樣品，去除變性劑和其他干擾生物分子(圖1A和1B)。而作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDC法提取的蛋白樣本不需要經(jīng)過(guò)氯仿-甲醇沉淀，而鑒定到的磷酸化蛋白更多，同時(shí)需要的植物材料更少。因此作者認(rèn)為SDC法更節(jié)省成本達(dá)到更好的效果，并在番茄、水稻、綠藻等生物中得到驗(yàn)證，從而確定了磷酸化蛋白組學(xué)的方法，稱之為GreenPhos。

圖1 GreenPhos的工作流程

2.?GreenPhos與當(dāng)前磷酸肽富集方法的比較

GreenPhos與當(dāng)前基于polyMAC的磷酸肽制備方法相比，在上機(jī)蛋白等量的情況下，GreenPhos方法平均鑒定出11072個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而polymac法鑒定出9399個(gè)磷酸化位點(diǎn) (圖2B)，表明GreenPhos的分析深度比PolyMAC的高18%，并且需要的樣本量更少，省去了更多的實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。與此同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)GreenPhos的富集選擇性(92%)也高于PolyMAC的富集選擇性(54%)（圖2C）?？赡茉蚴谴紊x物的存在影響了磷酸肽對(duì)TiO2珠的親和力，PolyMAC優(yōu)先富集磷酸化肽，而GreenPhos富集了更多的雙重或多重磷酸化肽(圖2D-E)。總之，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，GreenPhos優(yōu)于基于polyMAC的方法。

圖2 GreenPhos和基于polyMAC的方法的性能比較

為了進(jìn)一步測(cè)試GreenPhos的效率和靈敏度，作者從擬南芥葉片中提取蛋白質(zhì)(100、300、600和900μg)，分別從4個(gè)樣品中分別富集磷酸肽，并通過(guò)LC-MS分析（圖3A）。通過(guò)比較鑒定出的磷位點(diǎn)和磷酸肽的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者都隨著上機(jī)量的增加而增加，達(dá)到600μg后鑒定出的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化肽的小幅增加 (圖3A和3B)。說(shuō)明鑒定的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量與起始蛋白的數(shù)量不存在正相關(guān)，因?yàn)長(zhǎng)C-MS在使用相同的獲取參數(shù)時(shí)是飽和的。

為了評(píng)估GreenPhos在定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛力，作者了鑒定的磷酸化肽與上機(jī)量之間的定量關(guān)系。以900μg為參照，在100、300和600μg中，檢測(cè)到的磷酸肽強(qiáng)度比與參考中磷酸肽強(qiáng)度比的中位數(shù)與理論值具有很好的相關(guān)性(圖3C)。分析結(jié)果表明，GreenPhos與單次LC-MS結(jié)合可用于從高達(dá)600μg的蛋白質(zhì)中定量磷酸肽，準(zhǔn)確度高。通過(guò)5次重復(fù)質(zhì)譜分析，評(píng)價(jià)了GreenPhos在植物磷蛋白組定量鑒定中的再現(xiàn)性。5個(gè)生物重復(fù)和5個(gè)技術(shù)重復(fù)的磷酸肽強(qiáng)度的Pearson相關(guān)系數(shù)平均分別為0.95和0.97 (圖3D和3E)，表明具有較高的定量可重復(fù)性。從5個(gè)生物重復(fù)中共鑒定出磷酸化位點(diǎn)14063個(gè)，其中74%的磷酸化位點(diǎn)至少在2個(gè)重復(fù)中鑒定出 (圖3F)。結(jié)果表明，GreenPhos可以在定量和定性上產(chǎn)生高度可重復(fù)性的結(jié)果。

圖3 GreenPhos的靈敏度、定量準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性評(píng)價(jià)

4.?利用GreenPhos對(duì)擬南芥鹽脅迫誘導(dǎo)的磷酸化蛋白組分析

為了深入了解擬南芥對(duì)鹽脅迫響應(yīng)中蛋白磷酸化介導(dǎo)的信號(hào)，作者使用GreenPhos和單次LC-MS檢測(cè)，分析了100 mM NaCl處理30分鐘(T30)和120分鐘(T120)或未處理(T0)的擬南芥幼苗的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(圖4A)。每個(gè)處理包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)600μg蛋白用于磷酸肽的富集?？偣矎?316個(gè)磷酸化蛋白中鑒定出12908個(gè)磷酸肽，含有15889個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在磷酸肽中，13473個(gè)磷酸位點(diǎn)在處理的至少一個(gè)重復(fù)中包含可量化的信息。

對(duì)三個(gè)重復(fù)中至少任意兩個(gè)重復(fù)中的11128個(gè)磷酸位點(diǎn)進(jìn)行了label free定量。采用p< 0.05篩選不同處理間存在差異的磷酸化位點(diǎn)。聚類分析顯示，磷酸化蛋白形成了四個(gè)不同的簇，顯示了鹽脅迫誘導(dǎo)的磷酸化水平在所有處理中表現(xiàn)出顯著差異(圖4B)。在簇1中，磷酸化水平在鹽脅迫30 min后適度下降，在120 min后升高。在簇2中，磷酸化水平在30 min時(shí)總體上升，而在120 min后維持在相似的水平。在簇3中，磷酸化水平在30 min時(shí)沒有顯著變化，在120 min時(shí)下降。在簇4中，磷酸化水平在30 min鹽脅迫下下降，并在120 min時(shí)維持在類似的水平。

圖4 利用GreenPhos定量鑒定鹽脅迫下分析擬南芥幼苗磷酸化蛋白組

使用Fisher’s-exact對(duì)每個(gè)簇中的磷酸化蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析(圖5)。與報(bào)道一致，在細(xì)胞組分條目，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白在所有簇中被顯著富集。在分子功能條目，激酶活性在簇1、2和4中富集，而在簇3中不富集，但是蛋白質(zhì)去磷酸化的在生物過(guò)程條目在簇3中富集。結(jié)果表明，激酶的磷酸化激活和磷酸酶的去磷酸化是鹽脅迫誘導(dǎo)的重要反應(yīng)。

圖5 鹽脅迫誘導(dǎo)的差異磷酸化蛋白的功能富集

激酶通常通過(guò)識(shí)別特定的序列motif來(lái)磷酸化它們的底物，即磷酸化motif。使用motif-x算法?(https://meme-suite.org/meme/tools/momo)選擇在任意兩個(gè)處理中表現(xiàn)出差異水平的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化motif分析。在處理T30/T0之間顯示磷酸化增加的磷酸化位點(diǎn)中，四個(gè)motif?(SP、SDxE、SDxD和LxxxxS)被過(guò)度表達(dá)，而兩個(gè)motif?(SP和RxxS)在顯示磷酸化降低的磷酸化位點(diǎn)中過(guò)度表達(dá)(圖6A)。同樣，在120 min鹽脅迫(T120/T0)下，在磷酸化位點(diǎn)中，分別有4個(gè)motif（SP、SDxE、SDxD和SxxE）和3個(gè)motif（SP、RxxS、SxxE）的水平升高或降低(圖6B)。兩種處理(T120/T30)的比較顯示，在120 min鹽脅迫下，兩個(gè)motif（SP、SD）和motif（SP）在磷酸化位點(diǎn)中被過(guò)度表達(dá)，分別表現(xiàn)出更高和更低的磷酸化水平(圖6C)。

在所有處理中，富含脯氨酸的motif (SP)在上調(diào)和下調(diào)的磷酸位點(diǎn)中都被過(guò)度表達(dá)，并且通過(guò)PRM進(jìn)一步驗(yàn)證了β-淀粉酶1 (BAM1)上含有S55的一個(gè)motif (圖6)。緊接著作者鑒定了5個(gè)CDPKs的12個(gè)磷酸位點(diǎn)和3個(gè)MAPK上的4個(gè)磷酸位點(diǎn)，包括MPK19激活環(huán)上的一個(gè)磷酸位點(diǎn)，這些激酶被認(rèn)為和鹽脅迫相關(guān)。綜上所述，包括MAPKs和CDPKs在內(nèi)的多種激酶在鹽脅迫中起作用。

圖6 磷酸化對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)

除了激酶外，在簇1、2和4中剪接體被KEGG通路顯著富集 (圖5)，暗示磷酸化調(diào)控mRNA的可變剪接，是植物響應(yīng)脅迫的關(guān)鍵過(guò)程。在鹽脅迫下，18個(gè)剪接體蛋白上共有28個(gè)不同的位點(diǎn)被差異磷酸化 (圖7)。利用PRM進(jìn)一步驗(yàn)證了Y209在SCL30上的差異磷酸化(圖6)。據(jù)報(bào)道，RNA解旋酶及其磷酸化對(duì)剪接體的組裝至關(guān)重要。在鹽脅迫30分鐘后，Prp5的S210、S442和S444位點(diǎn)磷酸化增加，并在120分鐘后保持高水平，Prp19的多個(gè)亞基也觀察到類似的磷酸化模式(圖7)。盡管這些差異磷酸化事件的意義尚未得到明確的證明，但它們可能參與了鹽脅迫誘導(dǎo)的mRNA剪接的調(diào)控。

圖7 鹽脅迫誘導(dǎo)剪接體蛋白的差異磷酸化

GreenPhos不僅極大地提高了植物磷酸化蛋白質(zhì)組的解析效率，而且也顯著地減低了實(shí)驗(yàn)操作的難度和成本，為更深入地理解蛋白質(zhì)磷酸化在植物生命過(guò)程中的功能提供了強(qiáng)有力的工具。該研究成果將有效推進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與植物生物學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域的交叉融合，在發(fā)掘與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆密切相關(guān)的磷酸化蛋白及其位點(diǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。

今天，整理了2篇相關(guān)文獻(xiàn)追蹤帶給大家~

應(yīng)用研究論文一：糖尿病高發(fā)人群的血清代謝組學(xué)和血糖變化：西班牙裔社區(qū)健康研究/拉丁裔研究

主要研究?jī)?nèi)容

01 受試者特征-臨床指標(biāo)

在平均6年的隨訪期間，對(duì)西班牙裔社區(qū)健康研究/拉丁裔研究(HCHS/SOL)受試者中發(fā)現(xiàn)了224例糖尿病發(fā)病案例。與未患糖尿病的人相比，糖尿病身高體重指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、舒張壓(DBP)和甘油三酯水平較高，但高密度脂蛋白(LPL)水平較低。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者中使用降壓和降脂藥物以及糖尿病家族史的頻率也更高。

02 脂質(zhì)和氨基酸類代謝物與糖尿病

在對(duì)臨床相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究之后，對(duì)624種已知代謝物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中有134種代謝物與糖尿病發(fā)病顯著相關(guān)。110種代謝物與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，而其余24種代謝物與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。這134種重要代謝物主要包括脂質(zhì)(41.8%)和氨基酸(35.8%)類物質(zhì)。

03 代謝物模塊與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)最終形成了10個(gè)代謝物模塊，其中某些代謝物是與之前研究的代謝物一致(如脂質(zhì)類物質(zhì)和AA代謝物模塊)，均與糖尿病的發(fā)病相關(guān)。而另一些模塊可能由與糖尿病相關(guān)的新代謝物組成。大多數(shù)代謝物模塊與6年來(lái)各種血糖特征的變化有關(guān)，這些變化方向與糖尿病發(fā)病關(guān)聯(lián)的方向一致。同時(shí)證實(shí)了許多葡萄糖和能量代謝有關(guān)的代謝物與糖尿病發(fā)病是高度相關(guān)的。

此外的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了雄激素-類固醇代謝物與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的潛在新關(guān)聯(lián)。這些代謝物是硫酸化雄烯二醇和雄烷二醇。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些代謝物在男性中的水平高于女性，并隨著年齡的增長(zhǎng)而下降。但在本文的研究中，發(fā)現(xiàn)它們與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，只有在這些雄激素水平非常高的男性中，糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)才會(huì)顯著增加。

β-隱黃質(zhì)、異檸檬酸、蘇氨酸、N-甲基脯氨酸、草酸和酒石酸，與水果和蔬菜的飲食攝入量呈正相關(guān)，與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。這些代謝物存在于水果和蔬菜中，且其中一些代謝物(即β-隱黃質(zhì)、蘇氨酸、N-甲基脯氨酸)作為健康飲食模式的關(guān)鍵生物標(biāo)志物存在。

應(yīng)用研究論文二：糖尿病的蛋白組預(yù)測(cè)因子：社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化患病風(fēng)險(xiǎn)（ARlC）研究

主要研究?jī)?nèi)容

該研究選擇6010名北美社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)(ARIC)研究參與者，同時(shí)進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列（2913名ARIC研究參與者）和外部驗(yàn)證隊(duì)列（新加坡多民族（MEC）巢式病例對(duì)照研究，對(duì)照組1214名，糖尿病組624名）的構(gòu)建，對(duì)4955種血漿蛋白質(zhì)與糖尿病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性進(jìn)行了分析。鑒定了47種預(yù)測(cè)糖尿病發(fā)生發(fā)展的血漿蛋白質(zhì),建立了3種蛋白質(zhì)的因果效應(yīng)并確定了對(duì)診斷和治療具有潛在意義的糖尿病相關(guān)炎癥和脂質(zhì)通路。

01 糖尿病相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)

發(fā)現(xiàn)隊(duì)列（6010例）的參與者中，1435例確診為糖尿病患者。基于蛋白組學(xué)結(jié)果，初步分析有596種蛋白質(zhì)呈現(xiàn)顯著差異且與糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在對(duì)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、eGFR、生活方式、心臟代謝危險(xiǎn)因素及BMI進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)有140種蛋白與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。其中ADIPOQ、SLITRK3、IGFBP2、APOF、HTRA1與糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性最大。

02 糖尿病相關(guān)蛋白質(zhì)的驗(yàn)證

內(nèi)部驗(yàn)證：在內(nèi)部驗(yàn)證樣本（n=2913）中，有712例確診為糖尿病。同時(shí)在發(fā)現(xiàn)集中鑒定到64種蛋白質(zhì)與糖尿病發(fā)生發(fā)展具有顯著相關(guān)性。其中包括25種已知的與糖尿病發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)。

外部驗(yàn)證：對(duì)于這64種蛋白質(zhì)，進(jìn)一步在來(lái)自新加坡的外部隊(duì)列MEC（對(duì)照組1214名，糖尿病組624名）中進(jìn)行了驗(yàn)證。其中有47種與糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有顯著相關(guān)性。

03 蛋白質(zhì)通路分析

作者采用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路分析，結(jié)果顯示最關(guān)鍵的生物通路是急性期反應(yīng)信號(hào)通路。在上游調(diào)控因子分析中，發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子IL17a被確定為糖尿病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)的上游調(diào)節(jié)因子。而另一個(gè)上游調(diào)節(jié)因子是腫瘤壞死因子，作為細(xì)胞因子和炎癥信號(hào)的主要調(diào)節(jié)因子存在。

04 遺傳分析

作者通過(guò)蛋白組關(guān)聯(lián)分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析的雙孟德爾隨機(jī)化分析，確定了所構(gòu)建模型的64種蛋白質(zhì)中的3種SHBG、ATP1B2和GSTA1在糖尿病發(fā)病中的因果關(guān)系。

糖尿病發(fā)病機(jī)制及藥物治療機(jī)制的總結(jié)

●設(shè)計(jì)取樣：不同時(shí)期或者階段的糖尿病病人、包括但不限于二甲雙胍治療的糖尿病病人

●樣本類型：血漿、血清

●組學(xué)手段：代謝組、蛋白組、微生物、轉(zhuǎn)錄組

●最終目的：研究糖尿病的發(fā)病機(jī)制或藥物治療糖尿病的靶點(diǎn)所在

●實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

期刊名稱：PNAS

影響因子：12.779

合作單位：斯坦福大學(xué)

研究部位：根、莖、葉、枝條

研究方法：轉(zhuǎn)錄組、代謝組、體外酶活

研究背景

2021年6月，斯坦福大學(xué) Elizabeth S. Sattely 團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》PNAS發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：A metabolic regulon reveals early and late acting enzymes in neuroactive Lycopodium alkaloid biosynthesis。研究通過(guò)代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，確定了一組發(fā)育受控的生物合成基因，或潛在的調(diào)節(jié)子，用于調(diào)控石松生物堿的生物合成。

植物合成了許多能影響哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小分子化合物，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物先導(dǎo)的重要來(lái)源。一些重要神經(jīng)活性植物代謝物是賴氨酸衍生的生物堿，但植物合成這類化合物的機(jī)制在很大程度上仍未被闡明。為了更好地理解植物如何合成這些代謝物，作者團(tuán)隊(duì)聚焦于傳統(tǒng)草藥石松（Club moss）Phlegmariurus tetrastichus中石松生物堿（Lycopodium alkaloids）的生物合成研
究。迄今已報(bào)道發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種石松生物堿，包括乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉?jí)A甲（Huperzine A，HupA），其作為阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）治療藥物引起了科學(xué)家廣泛的研究興趣。

圖1 雜環(huán)亞胺的脂肪族生物堿的合成邏輯

實(shí)驗(yàn)材料

Phlegmariurus屬（以前被歸類為石杉屬）的品種：P. brassii，P. carinata，P. goebelli，P. salvinoides，P. squarrosus和P. tetrastichus，所有植物均在室溫和光照下生長(zhǎng)，并偶爾通過(guò)去離子水（DI）噴灑其根部來(lái)澆水。每周一次，向植物提供直接施用于根部的營(yíng)養(yǎng)液（Ionic Grow for Soil 3-1-5，Hydrodynamics International）。用于異源基因表達(dá)的本氏煙草植株在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度下，在生長(zhǎng)燈下以 16/8 小時(shí)的光/暗循環(huán)在 PRO MIX HP 菌根土壤（Premier Tech Horticulture）中生長(zhǎng)。選擇植物在萌發(fā)后 4 至 5 周進(jìn)行
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

1、轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)

取根、莖、葉、枝條，每組3個(gè)重復(fù)。

2、代謝組實(shí)驗(yàn)

取根、莖、葉、枝條，每組3個(gè)重復(fù)。

研究結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)錄組分析——石松生物堿生物合成研究

為了指導(dǎo)對(duì)石松生物堿生物合成的研究，作者重點(diǎn)關(guān)注 HupA，因?yàn)樗阎哂凶鳛?AChE 抑制劑的活性和作為藥物的潛力。HupA 由石松屬內(nèi)的物種產(chǎn)生，但這些物種的 HupA 積累水平差異很大。作者推斷物種中 HupA 的增加可能與上調(diào)的生物合成基因表達(dá)有關(guān)。因此，檢測(cè)了石松屬的幾個(gè)物種的 HupA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P. tetrastichus（圖 2A）積累了 HupA 到最高水平。因此，后續(xù)的研究將集中在該物種上。之前的研究表明，從頭 HupA 生物合成對(duì)P. tetrastichus枝條的新生長(zhǎng)具有特異性，接著作者通過(guò)氘同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，并且發(fā)現(xiàn)與莖相比，HupA標(biāo)記在葉中更廣泛分布，表明這里的生物合成基因表達(dá)富集（圖2B）。因此，作者對(duì)對(duì)該物種的多個(gè)組織進(jìn)行了RNA-seq分析，揭示石杉生物堿生物合成基因在活性組織中的積累機(jī)制。

圖2 石杉?jí)A甲的植物的代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)

為避免從頭轉(zhuǎn)錄組組裝的技術(shù)局限性，作者利用PacBio單分子實(shí)時(shí)（SMRT） 測(cè)序獲得了從 P. tetrastichus組織中分離的RNA的全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA（cDNA）序列，從而生成參考轉(zhuǎn)錄組，然后對(duì)多個(gè)植物組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.轉(zhuǎn)錄組分析——哌啶基-酮化物中間體合成基因發(fā)現(xiàn)

植物中雜環(huán)亞胺的產(chǎn)生，例如石松生物堿的 1-哌啶前體，涉及 Lys/Orn 氨基酸的脫羧，然后是所得多胺的氧化，這兩者幾乎是植物中常見的代謝過(guò)程。賴氨酸脫羧酶 （LDC） 酶和銅胺氧化酶（CAO） 是該途徑早期步驟的基因，作者進(jìn)一步研究LDC和CAO基因的代謝機(jī)制。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，作者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)LDC 同源基因（PtLDC-1和PtLDC-2）（圖 2C）和兩個(gè)CAO基因（PtCAO-1和PtCAO-2），并且發(fā)現(xiàn)PtCAO基因與 PtLDC基因具有強(qiáng)烈共表達(dá)，說(shuō)明它們參與了相同的代謝途徑，可能與石松生物堿的生物合成相關(guān)。

為了驗(yàn)證PtLDC和PtCAO基因的功能，在煙草葉片中單獨(dú)和共轉(zhuǎn)化。然后通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析葉提取物，以評(píng)估代謝物積累的變化。結(jié)果顯示，兩種 PtLDC 同源基因都顯著升高了尸胺水平（圖 3）。PtCAO同源基因與PtLDC同源基因的共表達(dá)導(dǎo)致生成的尸胺消耗和1-哌啶二聚體和三聚體的產(chǎn)生（圖3）。并且發(fā)現(xiàn)同源基因的功能是冗余的，因此在所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用PtLDC-2和PtCAO-1產(chǎn)生1-哌啶聚合物。

圖3 一種用于1-piperideine生物合成的重組途徑

3.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和 peletierine 關(guān)鍵酶基因發(fā)現(xiàn)

接下來(lái)，推測(cè)通過(guò)向 1-哌啶聚合物中添加丙二酰輔酶 A 衍生的聚酮鏈以產(chǎn)生 4-（2-哌啶基）乙酰乙酸（4PAA），該酸可以脫羧產(chǎn)生peletierine（圖 1B）。聚酮底物的產(chǎn)生表明聚酮合酶（PKS）酶參與催化這種亞胺-酮縮合反應(yīng)，并在石松生物堿的生物合成中起作用。進(jìn)一步分析揭示了兩個(gè)PKS候選基因（PtPIKS-1和PtPIKS-2），與PtLDC-1共表達(dá)基因之一（圖2C）。PtPIKS-1 PtPIKS-2與PtLDC-2 和PtCAO-1在煙草葉片中的瞬時(shí)共表達(dá)導(dǎo)致1-哌啶代謝物的消耗和幾種新化合物的產(chǎn)生。其中一種化合物具有與假定的石松生物堿前體peletierine相對(duì)應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù) （[M+H]=m/z
142.1226），并通過(guò)與合成標(biāo)準(zhǔn)品的比較來(lái)驗(yàn)證這一點(diǎn)（圖 3）。此外，作者觀察到與4PAA質(zhì)量數(shù)相同的化合物的產(chǎn)生（[M+H]=m/z 186.1125），其結(jié)構(gòu)分配由串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）碎裂支持（圖3）。作者認(rèn)為 4PAA（一種β酮酸）的自發(fā)脫羧會(huì)導(dǎo)致pelletierine的產(chǎn)生，煙草實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證這一點(diǎn)（圖 3）。綜上所述，PtPIKS-1和PtPIKS-2可能是石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和peletierine的關(guān)鍵酶。

為了更好地了解這種亞胺-酮縮合的機(jī)制，獲得了兩種PtPIKS同源基因的純化蛋白用于體外分析。與我們?cè)诒臼綗煵葜械慕Y(jié)果一致，當(dāng)添加 1-哌啶和丙二酰輔酶 A 作為底物時(shí)，PtPIKS-1和PtPIKS-2在體外測(cè)定中都產(chǎn)生了4PAA和pelletierine（圖4 A和B），此外還有其他幾種未知化合物。雖然當(dāng)單獨(dú)孵育 1-哌啶作為底物時(shí)沒有觀察到明顯的產(chǎn)物，但僅向PtPIKS-1添加丙二酰輔酶 A 會(huì)導(dǎo)致 3-氧代戊二酸的積累（圖 4 C 和 D）。3-氧代戊二酸的積累表明，PIKS能夠催化兩個(gè)丙二酰輔酶A單元縮合成硫酯連接的3-氧代谷氨?；鶊F(tuán)，并且該聚酮酸從硫酯鍵上酶促或非酶水解。

圖4 PtPIKS催化的亞胺-酮縮合反應(yīng)的體外分析

4.代謝組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中代謝物合成機(jī)制

研究報(bào)道指出，在石松屬和托烷生物堿生物合成中觀察到的亞胺-酮縮合是通過(guò) 3-氧代戊二酸與環(huán)亞胺共底物的非酶促脫羧縮合發(fā)生的。盡管這種非酶縮合是可能的，但作者想進(jìn)一步評(píng)估3-氧代戊二酸作為生物合成中間體的相關(guān)性。為此，比較了在含有PtPIKS-1的體外反應(yīng)中將3-氧代戊二酸或丙二酰輔酶A與1-哌啶配對(duì)時(shí) 4PAA/peletierine生產(chǎn)的反應(yīng)速率。雖然觀察到1-哌啶和3-氧代戊二酸在低水平下自發(fā)縮合，但當(dāng)丙二酰輔酶A作為與1-哌啶的共底物時(shí)，產(chǎn)物形成速率顯著增加（圖4E）。此外，在測(cè)量的底物濃度（2至200μM，圖4E），而丙二酰輔酶 A 和 1-哌啶之間的縮合顯然是酶依賴性的（圖4A和B）。因此，雖然1-哌啶和3-氧代戊二酸之間的自發(fā)縮合可以在低水平下發(fā)生，但這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)model，其中PIKS催化的縮合發(fā)生在1-哌啶和源自丙二酰輔酶A的聚酮硫酯之間。為了支持這一結(jié)論，當(dāng)丙二酰輔酶A作為PtPIKS-1的底物在體外被納入時(shí)，可以檢測(cè)到累積的乙酰乙酰輔酶A（圖4F）。乙酰乙酰輔酶A的積累雖然是間接的，但表明會(huì)產(chǎn)生一種3-氧代戊二酰輔酶A代謝物，該代謝物會(huì)迅速發(fā)生脫羧。作者無(wú)法直接檢測(cè)3-氧代戊二酰輔酶A，并推測(cè)這是由于這種中間體的瞬時(shí)、不穩(wěn)定性質(zhì)所致。有趣的是，乙酰乙酰輔酶A與1-哌啶發(fā)生酶非依賴性縮合，產(chǎn)生peletierine。然而，這種縮合不會(huì)產(chǎn)生4PAA，因此其在石松生物堿生物合成中的相關(guān)性尚不清楚。

通過(guò)LC-MS分析無(wú)法檢測(cè)到與4PAA-CoA硫酯有關(guān)的代謝物。因此，作者考慮了將 3-氧代谷二?；糠种匦录虞d到PtPIKS催化的半胱氨酸上之后發(fā)生亞胺-酮縮合的可能性。為了研究是否存在與PtPIKS-1的催化半胱氨酸結(jié)合的任何酰基中間體，作者用羥胺處理體外酶促反應(yīng)，羥胺已被用于捕獲硫酯中間體作為相應(yīng)的異羥肟酸衍生物。當(dāng)丙二酰輔酶A和1-哌啶作為底物時(shí)，作者注意到與4PAA的異羥肟酸相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量的羥胺（[M+H]=m/z201.1234，圖4G）。這一觀察結(jié)果，以及無(wú)法檢測(cè)到 4PAA-CoA代謝物，表明存在瞬時(shí)酶結(jié)合的4PAA硫酯。

總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)支持了這種亞胺-酮縮合的暫定機(jī)制（圖4H）：

1） 將丙二酰輔酶A加載到PIKS的催化半胱氨酸上；

2）第二個(gè)丙二酰輔酶A與酶結(jié)合的丙二?；目巳R森縮合，從而形成3-氧代戊二酰輔酶A；

3）將3-氧代谷氨?；糠种匦录虞d到酶上；

4）酶結(jié)合的聚酮與1-哌啶的脫羧縮合，產(chǎn)生酶結(jié)合的4PAA；

5）硫酯水解生成4PAA，在溫和條件下可自發(fā)脫羧生成pelletierine。

雖然需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示該反應(yīng)的精確事件順序和機(jī)理細(xì)節(jié)，但這些數(shù)據(jù)證明了PIKS在催化石松生物堿生物合成中的亞胺-酮縮合中的關(guān)鍵作用。

5.代謝組學(xué)分析——HupB的后期氧化反應(yīng)

目前研究尚未證實(shí) HupA 生物合成中的任何下游中間體，但從各種苔蘚物種中分離生物堿可能與兩個(gè)含8碳哌啶的亞基摻入石松生物堿的生物合成相關(guān)（圖 1B）。但是詳細(xì)的代謝合成機(jī)制還不清楚。作者通過(guò)與4PAA/peletierine生物合成的 3 個(gè)高度共表達(dá)基因分析，作者發(fā)現(xiàn)了富集最顯著的一類酶：Fe（II）/2-氧代戊二酸依賴性雙加氧酶（2OGDs）（圖2B，C）。作者將這些高度共表達(dá)的2OGD作為下游石松生物堿代謝途徑中的強(qiáng)候選基因。

與 HupA 天然共存的多種石松生物堿，包括石杉?jí)AB（HupB）和石杉?jí)AC （HupC），推測(cè)是其生產(chǎn)的邏輯途徑中間體，因此可能是潛在的前體（圖 1B）。盡管這些分子之前都沒有被驗(yàn)證為HupA前體，但在P. tetrastichus的新生長(zhǎng)組織中都可以檢測(cè)到HupB和HupC，支持了它們作為植物中潛在代謝中間體的結(jié)論。HupB的轉(zhuǎn)化需要C環(huán)哌啶部分的氧化裂解（圖1B）。因此，作者推測(cè)2OGD 以及細(xì)胞色素P450（CYP）和含黃素的單加氧酶（FMO）參與催化合成HupB。根據(jù)與PtLDC、PtCAO和PtPIKS基因的高共表達(dá)基因作為上述基因家族的候選基因，然后通過(guò)體外表達(dá)候選基因驗(yàn)證酶的活性功能。結(jié)果顯示，一種 2OGD酶（Pt2OGD-1） 消耗HupB并產(chǎn)生HupC，而第二個(gè)2OGD（Pt2OGD-2） 消耗HupC產(chǎn)生 HupA （圖5）。綜上所述，一對(duì)2OGD酶負(fù)責(zé)通過(guò)逐步氧化環(huán)裂解和中性雙鍵異構(gòu)化的氧化還原在石松生物堿生物合成中將HupB轉(zhuǎn)化為HupA。此外，之前的研究報(bào)道HupB 和HupC在生產(chǎn)HupA的植物中一直存在，但它們?cè)贖upA生物合成中的途徑尚未研究，因此作者的研究結(jié)果證明了它們?cè)谠撏緩街械闹虚g體作用。

圖5 三種 2OGD 酶催化 HupA 生物合成中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化

6. 代謝組分析——HupA生物合成途徑下游基因的解析

為進(jìn)一步研究其他下游生物合成途徑。特別是，兩種石松生物堿，des-N-methyl-α-obscurine（DNMAO）和des-N-methyl-β-obscurine（DNMBO），與HupB共享相同的碳骨架，可能是HupB的前體（圖 5）。因此作者通過(guò)與上述已知基因的高共表達(dá)分析及體外酶活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)另一種獨(dú)特的2OGD酶（Pt2OGD-3）能將DNMAO轉(zhuǎn)化為DNMBO（圖5），從而形成最終在HupA中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)。并且發(fā)現(xiàn)Pt2OGD-1和Pt2OGD-2可以依次作用于DNMBO，以產(chǎn)生假定的HupC和HupA的8,15-二氫同系物。Pt2OGD-1不作用 DNMAO，表明在DNMBO和HupB中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)的存在對(duì)Pt2OGD-1底物結(jié)合和/或催化活性至關(guān)重要，但是參與其中的去飽和酶尚未被發(fā)現(xiàn)。

本研究中鑒定的所有三個(gè)2OGD均與已發(fā)現(xiàn)的PtLDC-1高度相關(guān)（圖2C）。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了共表達(dá)分析可以作為鑒定石松生物堿生物合成調(diào)節(jié)基因的方法，并且這些鑒定的基因很可能在同一代謝途徑中起作用?？傮w而言，通過(guò)聯(lián)合使用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者確定了石松生物堿代謝基因的緊密共表達(dá)模塊，從而使我們能夠在HupA的生物合成中發(fā)現(xiàn)幾種生物合成酶（圖6）。

圖6 表征的HupA生物合成反應(yīng)的總結(jié)

研究總結(jié)

本研究揭示了新生長(zhǎng)組織中的特異性代謝物生物合成活性以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明石松生物堿生物合成的發(fā)育控制。植物生物堿的組織和細(xì)胞特異性，并且在新生長(zhǎng)組織中生物活性生物堿的產(chǎn)生可能增強(qiáng)了這些易感的新組織免受食草動(dòng)物的侵害方面的抗性作用。石松科物種的生長(zhǎng)緩慢和難以培養(yǎng)，因此通過(guò)解析石松生物堿合成途徑，有助于在體外進(jìn)行大規(guī)模代謝物生產(chǎn)。總的來(lái)說(shuō)，對(duì)HupA生物合成的轉(zhuǎn)錄和生化基礎(chǔ)的深入了解為未來(lái)對(duì)石松生物堿以及植物產(chǎn)生的許多其他神經(jīng)活性脂肪族生物堿的研究提供了基礎(chǔ)性的理解。