英文題目：CCR2+ monocytes promote memory CD8+ T-cell differentiation via membrane-bound TGF-β

研究單位：西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院院長張保軍教授團隊

期刊名：cellular & molecular immunology

影響因子：21.8

樣本類型：8-12周齡小鼠

文章采用技術(shù)：空間轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞RNA測序（scRNA-seq）

引言

在對抗感染和腫瘤的免疫戰(zhàn)場上，記憶?CD8+?T?細胞是守護機體的「長效衛(wèi)士」，?它們能快速識別再次入侵的病原體或癌細胞，發(fā)動強力攻擊。長久以來，樹突狀細胞（DC）被認為是主導(dǎo)記憶?T?細胞分化的核心「指揮官」。研究人員通過整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄（BMKMANU?S1000）技術(shù)，揭示了單核細胞才是調(diào)控記憶?CD8+?T?細胞分化的關(guān)鍵「操盤手」，其奧秘藏在「細胞接觸」與「分子信號」的雙重機制中。其中BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺大放異彩，成為揭CCR2+單核細胞促進記憶CD8+?T細胞分化的關(guān)鍵工具。

研究背景

CD8+?T細胞在適應(yīng)性免疫中扮演著關(guān)鍵角色，能夠保護機體免受病原體感染和消除惡性細胞。當(dāng)CD8+?T細胞識別到抗原后，會迅速增殖并分化為效應(yīng)CD8+?T細胞和記憶CD8+?T細胞。效應(yīng)CD8+?T細胞負責(zé)即時清除感染，而記憶CD8+?T細胞則提供長期保護，能夠在再次遇到相同抗原時迅速啟動免疫反應(yīng)。然而，單核細胞（monocytes）作為重要的髓系免疫細胞，雖在炎癥遷移中作用明確，但其是否直接參與T細胞分化尚無定論。

研究策略

動物模型與樣本制備

實驗動物：優(yōu)先選擇8-12周齡的CD45.1+/CD45.2+及OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠

樣本制備：脾臟單細胞懸液通過機械分離和紅細胞裂解（ACK緩沖液）制備

技術(shù)手段

• 流式細胞術(shù)分析

細胞分選：從感染LM-WT的小鼠脾臟中分選出cDCs、moDCs和單核細胞等抗原呈遞細胞（APCs）

細胞刺激與培養(yǎng)：將分選出的APCs與OVA肽段體外共孵育后，過繼轉(zhuǎn)移到已接受初始OT-I+?CD8+?T細胞的WT受體小鼠體內(nèi)，或與體外刺激的初始CD8+?T細胞共培養(yǎng)

表型檢測：通過流式細胞術(shù)檢測CD8+?T細胞的分化表型，包括記憶相關(guān)標(biāo)記物（如cKit、Sca1、Bcl6、TCF1和Eomes）的表達

• 空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)

樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進行切片，并進行H&E染色以確定組織形態(tài)學(xué)特征

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：利用BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對脾臟切片進行分析，揭示不同免疫細胞亞群在脾臟中的空間分布

數(shù)據(jù)整合：將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行整合，通過Seurat等工具的FindTransferAnchors和TransferData函數(shù)，將scRNA-seq中識別的細胞類型映射到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，實現(xiàn)細胞類型的空間定位

• 免疫熒光染色

樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進行切片，并進行免疫熒光染色

抗體選擇：使用特異性抗體標(biāo)記CD8+?T細胞、單核細胞（CCR2+）、樹突狀細胞（CD11c+）等關(guān)鍵細胞類型

結(jié)果分析：通過顯微鏡觀察并拍攝染色切片，分析不同細胞類型在脾臟中的共定位關(guān)系

• 生物信息學(xué)分析

差異基因分析：利用Wilcoxon秩和檢驗等統(tǒng)計方法，識別不同細胞亞群間的差異表達基因

通路富集分析：通過ClusterProfiler等工具對差異表達基因進行通路富集分析，揭示潛在的生物學(xué)過程

偽時間分析：利用Monocle3等工具構(gòu)建細胞分化軌跡的偽時間軸，分析CD8+?T細胞亞群在分化過程中的基因表達變化

研究結(jié)果

研究結(jié)果一：通過空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)繪制急性感染后脾組織的圖譜

為了研究免疫反應(yīng)過程中不同免疫細胞的空間分布和CD8+?T細胞分化的調(diào)節(jié)機制，研究人員通過整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，分析了急性感染模型中脾臟免疫細胞的空間分布與CD8??T細胞分化機制。實驗采用OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過李斯特菌（LM-OVA）感染誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：1）脾臟形成7個功能集群（B細胞、T細胞、單核/巨噬細胞等）；2）感染后T/B細胞區(qū)擴大，APCs（B細胞、DC、巨噬細胞）在T細胞區(qū)外圍聚集；3）空間重組與T細胞分化（MP/TE亞群）顯著相關(guān)。多組學(xué)整合揭示了免疫微環(huán)境的動態(tài)調(diào)控機制，為理解感染中細胞互作提供了多組學(xué)視角。

研究結(jié)果二：急性感染期間效應(yīng)和memoryCD8?T細胞分化軌跡不同

為了探索CD8+?T細胞分化的空間決定因素，特別是與近端細胞的相互作用，對于急性感染模型研究人員進行了亞群分析、分化路徑分析和功能驗證，結(jié)果表明在急性感染中，IFN反應(yīng)型CD8+?T細胞和CD8+MP?細胞之間分化軌跡的不同意味著，效應(yīng)和記憶CD8+?T細胞的命運決定于免疫反應(yīng)的初始階段，而IFN應(yīng)答和MP?CD8+?T細胞分別是效應(yīng)和記憶CD8+?T細胞分化途徑的初始階段。

研究結(jié)果三：跨組織區(qū)域細胞亞群的鑒定和空間圖譜

為了研究脾臟免疫細胞在感染前后的動態(tài)變化，研究人員通過整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，進一步鑒定了供體和受體脾臟中的免疫細胞群。結(jié)果顯示：①細胞組成：從1.6萬細胞中鑒定出19類，包括CD8??T細胞亞群（如記憶前體和IFN反應(yīng)性細胞）及髓系細胞。②動態(tài)變化：感染后第5天，T細胞區(qū)從以初始CD8+?T細胞為主轉(zhuǎn)為記憶前體和效應(yīng)細胞主導(dǎo)，且單核細胞取代DC成為主要浸潤的髓系細胞。③功能提示：不同的APC和CD8+?T細胞之間的相互作用在免疫反應(yīng)和CD8+?T細胞的分化中起著重要作用。

研究結(jié)果四：單核細胞和CD8+?MP細胞的抗原依賴性共定位

為了探索不同細胞類型之間潛在的細胞相互作用，研究人員通過評估特異性免疫細胞標(biāo)記物的表達、免疫熒光染色及空間轉(zhuǎn)錄組分析，檢查了第0天和第5天脾臟中CD8+?T細胞和單核細胞的空間分布。結(jié)果顯示單核細胞和CD8+?MP細胞以抗原刺激依賴性的方式在空間上共定位，表明單核細胞可能對CD8+?MP細胞的分化有關(guān)鍵影響。

研究總結(jié)

CD8+T?細胞是適應(yīng)性免疫的重要執(zhí)行者；特別是記憶CD8+?T細胞對強效和長期保護至關(guān)重要。CD8+?T細胞分化在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機制已被廣泛研究。然而，人們對感染過程中效應(yīng)和記憶CD8+?T細胞分化的空間要求仍然知之甚少。研究人員通過整合BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)和scRNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了記憶CD8+?T細胞分化的新機制，該機制涉及單核細胞和CD8+?MP細胞之間的解剖學(xué)鄰近性和TGF-β信號傳導(dǎo)。該研究結(jié)果闡述了記憶CD8+?T細胞命運決定的新機制，并強調(diào)單核細胞作為關(guān)鍵的APC群體，通過細胞間接觸依賴的方式在感染過程中促進記憶CD8+?T細胞的分化。