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宏轉(zhuǎn)錄組測序

從轉(zhuǎn)錄水平研究復(fù)雜微生物群落變化

宏轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)簡介

宏轉(zhuǎn)錄組 (Metatranscriptomics)主要從群體水平上研究環(huán)境樣品中微生物的全部轉(zhuǎn)錄本（即mRNA）?的表達(dá)水平及其在不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，并研究微生物與自然環(huán)境的相互關(guān)系。宏轉(zhuǎn)錄組能從轉(zhuǎn)錄水平研究復(fù)雜微生物群落變化，能更好的挖掘潛在的新基因。

通過對這些轉(zhuǎn)錄本進行大規(guī)模高通量測序，可以直接獲得環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)錄組信息。這種技術(shù)不僅具有宏基因組技術(shù)的全部優(yōu)點，可以檢測環(huán)境中的活性微生物、活性轉(zhuǎn)錄本以及活性功能進行研究，還可以比較不同環(huán)境下的差異表達(dá)基因和差異功能途徑，揭示微生物在不同環(huán)境壓力下的適應(yīng)機制，探索環(huán)境與微生物之間的互作機理。

宏轉(zhuǎn)錄組實驗流程

  • 1、環(huán)境樣品RNA抽提

  • 2、rRNA去除

  • 3、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫

  • 4、橋式PCR

  • 5、Illumina平臺測序

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析流程

宏轉(zhuǎn)錄組測序分析流程

分析結(jié)果展示

基因數(shù)目韋恩圖
基因數(shù)目韋恩圖不同顏色代表不同樣品/組，圈和圈重疊部分的數(shù)字代表對應(yīng)樣品/組之間共有的 Unigene個數(shù)，沒有重疊部分的數(shù)字代表樣本/組特有的Unigene個數(shù)。
Krona 分析
Krona分析圓圈從內(nèi)到外依次代表不同的分類級別（界門綱目科屬種）；扇形的大小代表不同物種的相對比例。
代謝通路注釋圖
代謝通路注釋圖方框為基因或蛋白；箭頭指向的節(jié)點為化學(xué)分子（即底物或產(chǎn)物）；圓角長方形為與本通路相關(guān)聯(lián)的其他通路，圖中高亮邊框表示能被本次測序的基因所注釋到。箭頭說明：酶反應(yīng)方向或信息傳遞方向等；實線表示直接作用，虛線表示間接作用。
物種-功能-豐度柱狀圖
物種-功能-豐度柱狀圖基于 NR 庫的物種注釋及 KEGG 、eggNOG 及 CAZy 功能注釋結(jié)果下，分別在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計物種/功能在各樣品中的相對豐度。選取各分類水平相對豐度排名前 10 名，繪制出各樣品的物種/功能豐度柱形圖。
樣品間相關(guān)系數(shù)熱圖
樣品間相關(guān)系數(shù)熱圖橫縱坐標(biāo)分別為各樣本，圖中顏色對應(yīng)兩樣本間的相關(guān)系數(shù)值。
物種-功能-Bubble圖
物種-功能-Bubble 圖Bubble圖利用氣泡的大小，直觀反映物種-功能-豐度二維矩陣中的數(shù)據(jù)信息。默認(rèn)對物種的phylum和species 水平、KEGG 、eggNOG 及 CAZy 各分類結(jié)果的豐度分布，以幫助尋找優(yōu)勢及差異的物種、KEGG、NOG 及 CAZy 功能等信息，以及分析其變化趨勢。

送樣要求

樣本 濃度 總量 備注
RNA樣品 ≥50ng/μL ≥1μg  

1.無基因組污染、無蛋白和雜質(zhì)污染、無顏色異常

2.濾膜直徑3-4cm/孔徑0.22或0.45μm

3.所有的核酸樣品，需要保存在1.5ml或2ml的EP管中
土壤、淤泥、沉積物 — ≥5g
糞便 — ≥2g
水體樣為濾膜 — ≥2張

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常見問題

1、RNA質(zhì)檢不合格怎么辦?

1、條帶完整性（RIN值）反應(yīng)RNA降解程度，RIN值偏低時（RIN＜3），可能會導(dǎo)致部分物種片段丟失，對序列拼 接等生信分析產(chǎn)生一定影響；

2、DNA污染，會嚴(yán)重影響文庫構(gòu)建，建庫時默認(rèn)進行DNA消化；

3、總量偏少（1ug<總量＜0.5 μg屬于B類風(fēng)險實驗），僅滿足單次建庫用量，若建庫結(jié)果未達(dá)標(biāo)則無法重新實驗；

4、總量不足（總量＜1 μg屬于C類），不滿足單次建庫用量，可嘗試風(fēng)險建庫，文庫構(gòu)建失敗概率較高，或文庫產(chǎn) 量低無法滿足上機測序要求，可能影響隨機性，若建庫結(jié)果未達(dá)標(biāo)則無法重新實驗，建議重新送樣

5、樣本收集過程導(dǎo)致RNA降解，建議重新送樣（樣本收集及處理時間過長；采樣后未能迅速液氮速凍；提取器械、 耗材等未進行去除RNA酶處理；未戴上手套和口罩等）

2、宏基因組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的區(qū)別

宏基因組測序是將環(huán)境總DNA提取出來，隨機打斷成300/500bp的小片段，然后在片段兩端加入通用引物進行PCR擴增測序，然后對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，再將高質(zhì)量序列拼接，根據(jù)數(shù)據(jù)庫參考信息，對基因序列進行預(yù)測和功能注釋，最終獲得重要的宏基因組信息，如序列組成（GC含量、基因組大小等）、物種組成、功能組成和群落特征等。

宏轉(zhuǎn)錄組測序是指從整體水平上研究某一特定環(huán)境、特定時期群體生命全部基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的研究手段。它以生態(tài)環(huán)境中的全部RNA為研究對象，提取環(huán)境微生物群落中的全部轉(zhuǎn)錄本，進行高通量測序和生物信息學(xué)分析，與宏基因組研究相輔相成，能夠很好地揭示復(fù)雜微生物群落的變化，有效地擴展微生物資源的利用空間。