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宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

從轉(zhuǎn)錄水平研究復(fù)雜微生物群落變化

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)簡(jiǎn)介

宏轉(zhuǎn)錄組 (Metatranscriptomics)主要從群體水平上研究環(huán)境樣品中微生物的全部轉(zhuǎn)錄本（即mRNA）?的表達(dá)水平及其在不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，并研究微生物與自然環(huán)境的相互關(guān)系。宏轉(zhuǎn)錄組能從轉(zhuǎn)錄水平研究復(fù)雜微生物群落變化，能更好的挖掘潛在的新基因。

通過對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行大規(guī)模高通量測(cè)序，可以直接獲得環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)錄組信息。這種技術(shù)不僅具有宏基因組技術(shù)的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，可以檢測(cè)環(huán)境中的活性微生物、活性轉(zhuǎn)錄本以及活性功能進(jìn)行研究，還可以比較不同環(huán)境下的差異表達(dá)基因和差異功能途徑，揭示微生物在不同環(huán)境壓力下的適應(yīng)機(jī)制，探索環(huán)境與微生物之間的互作機(jī)理。

宏轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程

  • 1、環(huán)境樣品RNA抽提

  • 2、rRNA去除

  • 3、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)

  • 4、橋式PCR

  • 5、Illumina平臺(tái)測(cè)序

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析流程

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析流程

分析結(jié)果展示

基因數(shù)目韋恩圖
基因數(shù)目韋恩圖不同顏色代表不同樣品/組，圈和圈重疊部分的數(shù)字代表對(duì)應(yīng)樣品/組之間共有的 Unigene個(gè)數(shù)，沒有重疊部分的數(shù)字代表樣本/組特有的Unigene個(gè)數(shù)。
Krona 分析
Krona分析圓圈從內(nèi)到外依次代表不同的分類級(jí)別（界門綱目科屬種）；扇形的大小代表不同物種的相對(duì)比例。
代謝通路注釋圖
代謝通路注釋圖方框?yàn)榛蚧虻鞍祝患^指向的節(jié)點(diǎn)為化學(xué)分子（即底物或產(chǎn)物）；圓角長(zhǎng)方形為與本通路相關(guān)聯(lián)的其他通路，圖中高亮邊框表示能被本次測(cè)序的基因所注釋到。箭頭說明：酶反應(yīng)方向或信息傳遞方向等；實(shí)線表示直接作用，虛線表示間接作用。
物種-功能-豐度柱狀圖
物種-功能-豐度柱狀圖基于 NR 庫(kù)的物種注釋及 KEGG 、eggNOG 及 CAZy 功能注釋結(jié)果下，分別在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種/功能在各樣品中的相對(duì)豐度。選取各分類水平相對(duì)豐度排名前 10 名，繪制出各樣品的物種/功能豐度柱形圖。
樣品間相關(guān)系數(shù)熱圖
樣品間相關(guān)系數(shù)熱圖橫縱坐標(biāo)分別為各樣本，圖中顏色對(duì)應(yīng)兩樣本間的相關(guān)系數(shù)值。
物種-功能-Bubble圖
物種-功能-Bubble 圖Bubble圖利用氣泡的大小，直觀反映物種-功能-豐度二維矩陣中的數(shù)據(jù)信息。默認(rèn)對(duì)物種的phylum和species 水平、KEGG 、eggNOG 及 CAZy 各分類結(jié)果的豐度分布，以幫助尋找優(yōu)勢(shì)及差異的物種、KEGG、NOG 及 CAZy 功能等信息，以及分析其變化趨勢(shì)。

送樣要求

樣本 濃度 總量 備注
RNA樣品 ≥50ng/μL ≥1μg  

1.無(wú)基因組污染、無(wú)蛋白和雜質(zhì)污染、無(wú)顏色異常

2.濾膜直徑3-4cm/孔徑0.22或0.45μm

3.所有的核酸樣品，需要保存在1.5ml或2ml的EP管中
土壤、淤泥、沉積物 — ≥5g
糞便 — ≥2g
水體樣為濾膜 — ≥2張

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常見問題

1、RNA質(zhì)檢不合格怎么辦?

1、條帶完整性（RIN值）反應(yīng)RNA降解程度，RIN值偏低時(shí)（RIN＜3），可能會(huì)導(dǎo)致部分物種片段丟失，對(duì)序列拼 接等生信分析產(chǎn)生一定影響；

2、DNA污染，會(huì)嚴(yán)重影響文庫(kù)構(gòu)建，建庫(kù)時(shí)默認(rèn)進(jìn)行DNA消化；

3、總量偏少（1ug<總量＜0.5 μg屬于B類風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)），僅滿足單次建庫(kù)用量，若建庫(kù)結(jié)果未達(dá)標(biāo)則無(wú)法重新實(shí)驗(yàn)；

4、總量不足（總量＜1 μg屬于C類），不滿足單次建庫(kù)用量，可嘗試風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建失敗概率較高，或文庫(kù)產(chǎn) 量低無(wú)法滿足上機(jī)測(cè)序要求，可能影響隨機(jī)性，若建庫(kù)結(jié)果未達(dá)標(biāo)則無(wú)法重新實(shí)驗(yàn)，建議重新送樣

5、樣本收集過程導(dǎo)致RNA降解，建議重新送樣（樣本收集及處理時(shí)間過長(zhǎng)；采樣后未能迅速液氮速凍；提取器械、 耗材等未進(jìn)行去除RNA酶處理；未戴上手套和口罩等）

2、宏基因組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的區(qū)別

宏基因組測(cè)序是將環(huán)境總DNA提取出來(lái)，隨機(jī)打斷成300/500bp的小片段，然后在片段兩端加入通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，然后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，再將高質(zhì)量序列拼接，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)參考信息，對(duì)基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能注釋，最終獲得重要的宏基因組信息，如序列組成（GC含量、基因組大小等）、物種組成、功能組成和群落特征等。

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指從整體水平上研究某一特定環(huán)境、特定時(shí)期群體生命全部基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的研究手段。它以生態(tài)環(huán)境中的全部RNA為研究對(duì)象，提取環(huán)境微生物群落中的全部轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，與宏基因組研究相輔相成，能夠很好地揭示復(fù)雜微生物群落的變化，有效地?cái)U(kuò)展微生物資源的利用空間。