上一次，小編帶大家一起看了兩棲動(dòng)物蠑螈神奇的斷肢再生。那么，是否有水生動(dòng)物也具有強(qiáng)大的再生能力呢？今天就為各位老師分享一篇關(guān)于斑馬魚心臟再生的單細(xì)胞&時(shí)空組學(xué)文章。

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表單位：柏林醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所

影響因子：41.307

發(fā)表時(shí)間：2022.07.21

DOI號(hào)：10.1038/s41588-022-01129-5

研究背景

成年哺乳動(dòng)物的心臟損傷通常會(huì)導(dǎo)致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚成為研究心臟再生細(xì)胞和分子機(jī)制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫?fù)p傷后，受傷的斑馬魚心臟會(huì)經(jīng)歷一個(gè)短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會(huì)通過去分化和增殖進(jìn)行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚心臟再生研究中，還沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來確定再生細(xì)胞的狀態(tài)和細(xì)胞類型的起源，對(duì)再生生態(tài)位的細(xì)胞組成、潛在的信號(hào)傳遞和相互作用的認(rèn)識(shí)仍不全面。目前對(duì)活化巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的定義嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚心臟再生過程中細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性。

材料方法

單細(xì)胞RNA-seq ：

空間轉(zhuǎn)錄組（Tomo-seq）：斑馬魚心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq

方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術(shù)的譜系追蹤

研究結(jié)果

1. 再生心臟的細(xì)胞組成

為了系統(tǒng)地識(shí)別健康和再生斑馬魚心臟中的細(xì)胞類型，作者對(duì)損傷前后不同階段的大約20萬個(gè)解離細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq（圖1a）。為了準(zhǔn)確得到細(xì)胞發(fā)育起源的相關(guān)信息，作者還應(yīng)用了一種基于CRISPR–Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法，通過注射Cas9和針對(duì)多拷貝轉(zhuǎn)基因(斑馬魚系中的dTomato：一種用于斑馬魚細(xì)胞追蹤和譜系分析的多光譜細(xì)胞標(biāo)記)的sgRNA，創(chuàng)建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來記錄早期發(fā)育中的譜系關(guān)系。

作者首先評(píng)估了健康和再生心臟中的細(xì)胞類型多樣性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類分析顯示了所有主要的心臟細(xì)胞類型。正如預(yù)期的那樣，觀察到成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞在損傷后強(qiáng)烈增加（圖1b）。進(jìn)一步檢查聚類數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，心臟的三個(gè)主要層:心外膜、心肌和心內(nèi)膜的細(xì)胞類型之間存在一個(gè)亞結(jié)構(gòu)。作者假設(shè)，由于心房和心室中這些細(xì)胞類型的功能差別，這種細(xì)胞類型的亞結(jié)構(gòu)可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機(jī)沿感興趣的軸對(duì)組織進(jìn)行切片，然后在每個(gè)切片上進(jìn)行RNA-seq的技術(shù)）進(jìn)行空間分辨率轉(zhuǎn)錄組，并將空間數(shù)據(jù)解卷積為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，可以驗(yàn)證一些細(xì)胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖1d）。

圖1?再生心臟的細(xì)胞組成

2. 心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類型多樣性

作者進(jìn)一步確定了心肌細(xì)胞中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄亞結(jié)構(gòu)（圖2a）。除了以表達(dá)ATP合成和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細(xì)胞外，還檢測(cè)到一個(gè)較小的與心肌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區(qū)去分化心肌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這些去分化心肌細(xì)胞是心臟再生的標(biāo)志，其數(shù)量在3 d.p.i.（受傷后天數(shù)）增加了(圖2a)，并與已建立的標(biāo)記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。

作者注意到心臟再生中三個(gè)成熟的信號(hào)因子在成纖維細(xì)胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細(xì)胞有絲分裂原nrg1和再生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細(xì)地研究心臟成纖維細(xì)胞的多樣性，作者對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類。結(jié)果顯示出驚人的多樣性，有13個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的成纖維細(xì)胞聚類(圖2c)。這13個(gè)基因簇在ECM相關(guān)基因的表達(dá)譜上表現(xiàn)出明顯的差異（圖2d），但它們的轉(zhuǎn)錄組多樣性遠(yuǎn)不止于此——去除ECM相關(guān)基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細(xì)胞亞型。

3. 心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定

為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細(xì)胞亞型，作者分析了損傷后細(xì)胞簇的動(dòng)力學(xué)。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達(dá)的3簇成纖維細(xì)胞在再生高峰期短暫出現(xiàn)?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個(gè)基因簇稱為細(xì)胞狀態(tài)，而不是細(xì)胞類型（圖3a）。為了對(duì)鑒定的成纖維細(xì)胞進(jìn)行空間分辨，作者進(jìn)行了熒光原位雜交證實(shí)了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞狀態(tài)在邊界區(qū)以及損傷區(qū)的位置（圖3b）。之后發(fā)現(xiàn)nrg1在col12a1a成纖維細(xì)胞中特別高的表達(dá)，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖3c）。作者推斷瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅(qū)動(dòng)的。生物信息學(xué)分析顯示，與未損傷的對(duì)照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達(dá)在3 d.p.i.和7 d.p.i.時(shí)增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞中分泌組基因的表達(dá)在所有檢測(cè)到的細(xì)胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。

雖然作者對(duì)單細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)空分析強(qiáng)烈表明了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞的再生功能，但還需要額外的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一假設(shè)。為了從功能上評(píng)估瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統(tǒng)進(jìn)行靶向細(xì)胞剔除。在MTZ處理后的轉(zhuǎn)基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時(shí)相較于對(duì)照，5 / 6的心臟顯示心肌細(xì)胞增殖減少，col12aa表達(dá)細(xì)胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時(shí)，col12a1⁺細(xì)胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）。總之，作者確定了心臟再生過程中具有潛在再生作用的三種成纖維細(xì)胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細(xì)胞?；蚣?xì)胞剔除數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明col12a1a表達(dá)細(xì)胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。

4. 心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定

接下來，作者想要闡明短暫成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機(jī)制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細(xì)胞通過可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標(biāo)記，它們由Cas9在早期發(fā)育過程中產(chǎn)生，其獨(dú)特的序列能夠識(shí)別疤痕產(chǎn)生時(shí)來自同一親本的細(xì)胞。通過對(duì)同一個(gè)單細(xì)胞的遺傳疤痕和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，作者便可以建立譜系樹，揭示這些細(xì)胞類型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)中的所有細(xì)胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節(jié)點(diǎn)就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個(gè)節(jié)點(diǎn)上不同瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)下的每個(gè)細(xì)胞均可在相同的上一節(jié)點(diǎn)中對(duì)應(yīng)找到（比如在圖4a的譜系圖中節(jié)點(diǎn)C就包含了3種瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細(xì)胞均可以在上一節(jié)點(diǎn)的對(duì)應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)中找到）。作者還計(jì)算了不同樹節(jié)點(diǎn)中細(xì)胞類型比率之間的相關(guān)性，以確定哪些細(xì)胞類型通過譜系相關(guān)聯(lián)（圖4b）。譜系相關(guān)性聚類熱圖顯示，在3 d.p.i.時(shí)有4簇細(xì)胞類型，在7 d.p.i.時(shí)有7簇細(xì)胞類型。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有的免疫細(xì)胞共享一個(gè)相同的譜系。此外，幾種成纖維細(xì)胞：col11a1a、col12a1a和構(gòu)成型成纖維細(xì)胞，它們和心外膜細(xì)胞聚集在一起，這表明這些成纖維細(xì)胞與心外膜細(xì)胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，作者又構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達(dá)的mCherry與內(nèi)源性表達(dá)的col12a1a共定位（圖4e），證實(shí)了瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細(xì)胞的起源。為了進(jìn)一步闡明短暫心外膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，作者應(yīng)用了RNA速度分析方法，對(duì)心外膜譜系簇中所有心室細(xì)胞類型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進(jìn)行推斷（圖4f），得到了相同的結(jié)論。

5. 心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定

瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞和其他幾個(gè)成纖維細(xì)胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細(xì)胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時(shí)不屬于心外膜譜系，但與心內(nèi)膜以及彼此之間顯示中度正相關(guān)。基于相關(guān)性的分析有一個(gè)潛在的假設(shè)，即所有克隆體都會(huì)表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)換率（圖5a），但是這種假設(shè)并不適用于所有細(xì)胞類型，于是作者引入條件概率開發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時(shí)，不同成纖維細(xì)胞類型：col11a1a成纖維細(xì)胞、構(gòu)成型成纖維細(xì)胞、心外膜(心室)轉(zhuǎn)變?yōu)?em>col12a1a成纖維細(xì)胞類型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時(shí)，不同的心內(nèi)膜細(xì)胞類型：心內(nèi)膜（心房）、心內(nèi)膜（心室）和心內(nèi)膜 ( frzb )轉(zhuǎn)變?yōu)?em>nppc成纖維細(xì)胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細(xì)胞類型與心內(nèi)膜之間存在譜系關(guān)系。為了驗(yàn)證算法的真實(shí)性，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達(dá)的EGFP與內(nèi)源性表達(dá)的nppc共定位（圖5e），證實(shí)了瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞的心內(nèi)膜起源。RNA速度分析揭示了心室內(nèi)膜和nppc成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性和潛在的過渡路徑（圖5f）。從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到，與健康對(duì)照組心臟相比，心內(nèi)膜在7 d.p.i.時(shí)發(fā)生了激活反應(yīng)（圖5g）。

6. 典型Wnt信號(hào)通路作用的細(xì)胞解剖

作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中表達(dá)了許多與Wnt信號(hào)有關(guān)的基因(配體、受體和調(diào)節(jié)劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們?nèi)パ芯縒nt信號(hào)在斑馬魚心臟再生過程中的作用。一方面，Wnt通常被認(rèn)為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對(duì)斑馬魚鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞去分化和增殖中的作用存在爭(zhēng)議。于是，作者在斑馬魚心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號(hào)抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號(hào)，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制導(dǎo)致心臟再生顯著延遲，與對(duì)照組相比，心肌纖維化延長(zhǎng)，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示心肌細(xì)胞去分化延遲，與對(duì)照組相比，去分化心肌細(xì)胞數(shù)量在3 d.p.i.時(shí)減少，而在7 d.p.i.時(shí)未定位于損傷區(qū)域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細(xì)胞和所有心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細(xì)胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細(xì)胞總體上保持在類似水平（圖6d）。通過熒光原位雜交也證實(shí)了，Wnt信號(hào)對(duì)于心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的激活是必需的，類似于所描述的Wnt在誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。

為了評(píng)估血管再生，作者對(duì)4d.p.i.下冠脈內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈的覆蓋范圍進(jìn)行了定量分析。發(fā)現(xiàn)注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時(shí)有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時(shí)，損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結(jié)果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導(dǎo)的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關(guān)。

圖6 對(duì)典型Wnt信號(hào)作用的細(xì)胞剖析

總? 結(jié)

成年斑馬魚心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和時(shí)空分析，解剖了再生斑馬魚心臟中激活細(xì)胞狀態(tài)的多樣性。觀察到損傷后出現(xiàn)的幾種具有成纖維細(xì)胞特征的瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，并概述了表達(dá)膠原-12的成纖維細(xì)胞的促再生功能。為了了解導(dǎo)致心臟再生的級(jí)聯(lián)事件，作者通過高通量譜系追蹤確定了這些細(xì)胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細(xì)胞有兩個(gè)不同的來源:心外膜和心內(nèi)膜。在機(jī)制上，確定Wnt信號(hào)作為心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)器。總之，本文確定了促進(jìn)心臟再生的特殊活化成纖維細(xì)胞狀態(tài)，從而為調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物心臟再生能力開辟了可能的途徑。

 

如果您對(duì)我們提供的服務(wù)感興趣，歡迎聯(lián)系我們，我們將免費(fèi)為您設(shè)計(jì)文章思路。

參考文獻(xiàn)

Hu B, Lelek S, Spanjaard B, El-Sammak H, Sim?es MG, Mintcheva J, Aliee H, Sch?fer R, Meyer AM, Theis F, Stainier DYR, Panáková D, Junker JP. Origin and function of activated fibroblast states during zebrafish heart regeneration. Nat Genet. 2022 Aug;54(8):1227-1237.