1、提取方法
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒
3)動物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測方法
2.1檢測方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進行檢測
2.2判定標準
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 全長cDNA的合成
A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Total RNA（1ug） | X |
| 3’ SMART?CDS Primer II A (12 μM) | 1 |
| Nuclease-Free Water | 3.5-X |
| Total Volume | 4.5 |
B.輕彈混勻，瞬時離心，置于PCR儀上
C.72℃ 3min，42℃ 2min，72℃到42℃降溫速率設置為 0.1℃/s
D.在上步反應期間，配制如下Mix
| Reagent | Volume（μL） |
| 5X First-Strand Buffer | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.25 |
| dNTP Mix (10 mM ) | 1 |
| SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM) | 1 |
| RNase Inhibitor | 0.25 |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) | 1 |
| Total volume added per reaction | 5.5 |
E.輕彈混勻，瞬時離心，42℃預熱1min后立即進行下步反應
F.取5.5μL預熱的Master Mix加入上步反應完成的PCR管中；輕彈混勻，瞬時離心
G.42℃ 90min，70℃ 10min
H.向上述反應完成的cDNA產(chǎn)物中加入70 μL Elution Buffer（試劑盒自帶，后邊簡稱EB）進行稀釋（總體積80μL）
2)PCR擴增
A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Diluted first-strand cDNA | 80 |
| 5’ PCR Primer II A (12 μM) | 8 |
| 5X PrimeSTAR GXL buffe (5X) | 80 |
| dNTP Mix (2.5 mM each) | 32 |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25 U/μL） | 8 |
| Nuclease-free water | 192 |
| Total Volume | 400 |
| Reagent | Volume（μL） |
B.輕彈混勻，瞬時離心，將Mix平均分到0.2mL PCR管中（每管50μL）
C.將PCR管置于PCR儀上，按照PCR條件進行PCR擴增
| 98℃ | 30s | |
| 98℃ | 10s | 12cycles |
| 65℃ | 15s | |
| 68℃ | 10min | |
| 98℃ | 5min |
3)PCR純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導入一新的1.5mL低吸離心管中
B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.5X（25μL）體積的AMPure?XP磁珠，充分混勻，瞬時離心
C.置于四維旋轉儀上混勻結合15 min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入1.5mL的新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥30 s
H.向兩個1.5mL離心管分別加入22μL的Elution Buffer，輕彈混勻，置于四維旋轉儀上5min
I.置于磁力架上2min，轉移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量
4)DNA修復
A. 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Repair buffer | 8 |
| End repair Mix | 4 |
| DNA repair mix | 2 |
| 總體積（Reaction Mix 1） | 14 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個樣品中加入14μL Reaction Mix 1
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 37℃ | 30 |
| 65℃ | 5 |
| 4℃ | Hold |
5)接頭連接
A.向上述產(chǎn)物中加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| SMRTbell adapter | 4 |
| Ligation mix | 30 |
| Ligation enhancer | 1 |
| 總體積（Reaction Mix 2） | 35 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個樣品中加入35μL Reaction Mix 2
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 20℃ | 30 |
| 4℃ | Hold |
6)PB純化
A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30min）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.室溫放置10min，瞬離1s
D.轉移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉移到新離，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
H.室溫5min溶解DNA，瞬離1s
I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定
4、測序方法
1)使用Sequel II Binding kit 2.1（Pacbio，USA） 對上機文庫進行上機前的結合，使文庫結合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
2)將最終的反應產(chǎn)物進行AMPure PB（Pacbio，USA）純化后置于SequelII（Pacbio，USA）測序儀上進行測序
5、實驗試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 貨號 |
| SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit | TAKARA | 634925 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 |
| Agencourt? AMPure? XP | Beckman | A63882 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 |
| AMPure PB | PACBIO | 102-182-500 |
| Sequel II Binding kit 2.1 | PACBIO | 101-626-600 |
| Sequel II Sequencing 2.0 Bundle (5 pack of 4 rxn plates) | PACBIO | 101-849-000 |
| SMRT Cell 8M | PACBIO | 101-389-001 |
6、實驗設備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號 |
| 瞬時離心機 | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測序儀 | Pacbio | SequelII |
京公網(wǎng)安備 11011302003368號